REGENERASI TUNAS Abstract
5 PEMBAHASAN UMUM
Pemanfaatan buah tomat di Indonesia selain dikonsumsi dalam bentuk segar juga Produktivitas tomat di Indonesia masih tergolong rendah (BPS 2015), bila dibandingkan dengan potensi hasil yang dapat diperoleh (FAO 2015). Oleh karena itu program pemuliaan tomat terus dilakukan untuk mendapatkan varietas unggul yang memiliki produksi tinggi dan sifat-sifat unggul lainnya. Pemanfaatan teknik kultur antera dalam program pemuliaan tomat diharapkan dapat mempercepat perakitan varietas unggul baru.
Pemanfaatan kultur antera pada tanaman tomat menemui beberapa kendala yaitu keberhasilan yang sangat ditentukan oleh genotipe, fase perkembangan mikrospora, komposisi media kultur, konsentrasi dan jenis zat pengatur tumbuh, pra perlakuan sebelum kultur, kondisi fisiologi tanaman donor, dan kondisi lingkungan kultur. Walaupun memiliki banyak faktor pembatas keberhasilan, namun penelitian kultur antera tomat terus berkembang hingga saat ini dikarenakan tomat merupakan komoditas yang memiliki nilai ekonomi penting di dunia.
Penelitan kultur antera di Indonesia belum banyak dilakukan. Hal ini karena fase perkembangan mikrospora dan media kultur antera tomat yang sesuai hingga saat ini belum diketahui, sehingga penelitian ini adalah penelitian awal untuk mengetahui tanggap androgenesis tomat yang ada di Indonesia. Terdapat dua percobaan dalam penelitian ini yaitu percobaan identifikasi fase perkembangan mikrospora hubungannya dengan pemilihan antera sebagai eksplan dalam kultur antera dan percobaan induksi kalus dan regenerasi tanaman. Perbedaan mendasar dari penelitian ini adalah genotipe dan media yang digunakan belum pernah digunakan dalam kultur antera tomat di Indonesia.
Hasil percobaan identifikasi fase perkembangan mikrospora menunjukkan bahwa genotipe yang berbeda menunjukkan perbedaan panjang kuncup dan antera yang mengandung fase meiosis, tetrad dan mikrospora. Percobaan 1 menggunakan antera yang mengandung fase meiosis, tetrad hingga mikrospora sebagai eksplan dalam kultur antera tomat. Fase ini merupakan fase-fase perkembangan mikrospora yang terbukti dapat menginduksi kalus pada penelitian-penelitian sebelumnya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kalus dapat diinduksi pada fase meiosis, tetrad hingga mikrospora. Namun, fase yang paling optimal dalam penelitian ini tidak diamati. Hal ini karena penelitian ini adalah penelitian pendahuluan untuk mengetahui secara garis besar respon antera pada berbagai fase mikrospora tersebut pada masing-masing genotipe terhadap kemampuan induksi kalus dan regenerasi tanaman, dengan alasan bahwa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa semua fase mikrospora dapat menginduksi kalus. Penelitian lebih lanjut dapat ditujukan untuk mengetahui fase yang paling optimal di antara ketiga fase tersebut pada tiap genotipe yang digunakan, sehingga perlu dilakukan inokulasi antera secara terpisah berdasarkan panjang kuncup dan genotipe yang digunakan untuk dapat menghitung antera berespon per panjang kuncup pada masing-masing genotipe. Dengan demikian dapat diketahui fase yang optimal pada masing-masing genotipe.
Percobaan 2 terdiri atas dua percobaan yaitu percobaan induksi kalus pada enam media kalus dan percobaan induksi tunas pada dua media regenerasi. Eksplan yang digunakan pada percobaan ini berasal dari kuncup bunga yang berukuran 3 mm hingga 7 mm. Hal ini didasarkan karena panjang kuncup 2 mm pada percobaan
31
pendahuluan tidak menginduksi kalus sama sekali, sedangkan ukuran 6 hingga 7 mm digunakan untuk membandingkan jumlah antera yang berespon pada ukuran tersebut dengan panjang kuncup 3, 4 dan 5 mm. Pemilihan panjang kuncup sebagai
eksplan pada percobaan dua didasari oleh pendapat Summers et al. (1992) bahwa
semua fase dalam perkembangan mikrospora dapat menginduksi kalus. Selain fase meiosis, fase tetrad dan uninukleat juga dapat menginduksi kalus pada percobaan- percobaan sebelumnya (Zamir et al. 1980). Umumnya induksi kalus pada tomat terjadi setelah 4 hingga 10 minggu dan tergantung pada genotipe yang digunakan. Namun demikian, waktu yang lebih optimal adalah 3 hingga 4 minggu. Pada penelitian ini dipilih enam minggu dengan alasan bahwa pada penelitian pendahuluan, induksi kalus mulai terjadi minggu ketiga, dengan puncaknya pada minggu ke empat hingga minggu ke enam. Setelah enam minggu tanggap antera yang berkalus semakin berkurang.
Hasil percobaan induksi kalus menunjukkan bahwa genotipe hibrida Permata memiliki jumlah kalus paling banyak dibandingkan genotipe Tora dan Ratna. Hal ini dapat disebabkan karena tomat Permata yang ditanam sebagai tanaman donor akan menyumbang kuncup yang mengandung antera sebagai gamet untuk membentuk keturunan F2 yang memiliki tingkat heterozigositas tinggi. Banyaknya kombinasi heterozigositas yang mungkin terjadi membentuk kombinasi gen-gen yang memiliki responsivitas tinggi terhadap media maupun zat pengatur tumbuh yang digunakan. Dengan demikian akumulasi jumlah antera berespon yang menghasilkan kalus akan lebih banyak pada antera dari tanaman F1. Hal ini juga dibuktikan oleh penelitian Motallebi-Azar 2010a menunjukkan bahwa jumlah kalus, diameter kalus dan jumlah tanaman paling banyak dihasilkan oleh antera yang berasal dari tanaman F1 dibandingkan dengan tetuanya. Hasil yang sama juga dilaporkan Safitri et al. (2010) pada tanaman padi yaitu F1 hasil penelitiannya memiliki jumlah kalus dan jumlah tanaman total yang lebih banyak dibandingkan dengan tetuanya.
Jumlah kalus dan tunas genotipe Tora dan Ratna tidak lebih tinggi dibandingkan Permata dapat dikarenakan genotipe Tora dan Ratna adalah galur murni, sehingga kemampuan induksi kalus dan regenerasi tanaman yang rendah menjadi referensi bahwa kedua genotipe memiliki respon yang rendah sehingga perlu dilakuan persilangan terlebih dahulu untuk mendapatkan keragaman genetik yang lebih lanjut akan mendapatkan keragaman respon induksi kalus dan regenerasi tanaman. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa antera dari tanaman galur murni akan menyumbang antera yang juga mengandung susunan genetik galur murni, sehingga hasil induksi kalus dan regenerasinya merupakan jawaban kemampuan genotipe tersebut terhadap kultur antera.
Hasil penelitian ini turut membuktikan bahwa genotipe menjadi faktor penting yang menentukan keberhasilan induksi kalus maupun regenerasi. Tomat termasuk ke dalam kelompok rekalsitran in vitro selain cabai dan terung, sehingga respon terhadap kultur in vitro sangat bervariasi (Segui-Simarro dan Nuez 2005; 2007). Genotipe yang responsif akan memberikan respon yang baik pada karakter yang diamati begitu pula sebaliknya. Pengaruh genotipe dalam menentukan keberhasilan induksi kalus dan regenerasi tanaman dalam kultur antera tomat juga dilaporkan oleh beberapa peneliti sebelumnya (Gresshoff dan Doy 1972; Shtereva et al. 1998; Zagorska et al. 2004; Asoliman et al. 2007; Motallebi-Azar 2010a).
Media merupakan faktor yang juga sangat menentukan keberhasilan kultur antera tomat. Kandungan zat pengatur tumbuh di dalam media memegang peranan penting dalam menentukan arah morfogeneisis dari eksplan yang dikultur. Zat pengatur tumbuh dalam mempengaruhi morfogenesis tanaman, paling tidak dipengaruhi oleh salah satu faktor diantaranya jumlah hormon endogen yang tersedia, lokasi dari zat pengatur tumbuh, dan sensitivitas dari jaringan tanaman (Davies 2004).
Sensitivitas jaringan merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan transduksi sinyal dari zat pengatur tumbuh ke dalam jaringan target. Hal ini melibatkan keberadaan reseptor dan komponen rantai transduksi signal (Davies 2004). Tomat dikenal sebagai tanaman yang rekalsitran in vitro, karena memberikan respon yang rendah terhadap kultur in vitro. Hal ini dapat diduga karena sensitivitas atau respon dari jaringan tanaman tomat tidak baik, yang diduga dipengaruhi oleh ketidakstabilan reseptor dan komponen rantai transduksi sinyal, namun hal ini perlu diteliti lebih jauh.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa media M1 dengan kombinasi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh 5 mg L-1 Kinetin + 2 mg L-1 NAA mampu menghasilkan jumlah kalus paling banyak pada ketiga genotipe yang digunakan. Media M2 yang juga mengunakan kombinasi zat pengatur tumbuh yang sama namun dengan konsentrasi berbeda menunjukkan jumlah kalus yang tidak berbeda. Media lainnya yang menggunakan kombinasi zat pengatur tumbuh Zeatin + IAA, 2ip + IAA, 2.4-D + Kinetin memberikan hasil yang lebih rendah pada ketiga genotipe yang digunakan. Hasil penelitian ini turut membuktikan bahwa kombinasi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang tepat dapat mendukung proses morfogenesis. Menurut Shtereva et al. (1998) pengaruh zat pengatur tumbuh terhadap keberhasilan induksi kalus dan regenerasi tanaman tergantung dari genotipe yang digunakan. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa kombinasi 2ip + IAA adalah kombinasi yang paling baik untuk induksi kalus dan organogenesis pada kultur antera tomat dibandingkan dengan kombinasi Zeatin + IAA. Berbeda dengan hasil penelitian ini yang menunjukkan bahwa Zeatin tunggal maupun kombinasi Zeatin dan IAA ialah kombinasi yang dapat menginduksi tunas dibandingkan dengan kombinasi zat pengatur tumbuh lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa kebutuhan zat pengatur tumbuh baik jenis maupun konsentrasi dapat berbeda-beda pada tiap genotipe yang digunakan.
Dibandingkan media MS, media DBM memiliki konsentrasi hara makro yang lebih tinggi dibandingkan dengan media MS (Lampiran 1). Perbedaan konsentrasi yang cukup tinggi pada media DBM menunjukkan bahwa tomat mungkin saja menghendaki konsentrasi yang cukup tinggi untuk dapat merangsang dan
mengarahkan pertumbuhannya secara in vitro. Dapat dikatakan bahwa untuk
tanaman yang rekalsitran in vitro seperti tomat membutuhkan konsentrasi hara yang cukup tinggi untuk dapat merangsang dan mengaktifkan proses-proses fisiologi selama proses pertumbuhannya membentuk kalus. Morfologi kalus yang sangat lunak dan mengandung banyak air mungkin menjadi alasan mengapa konsentrasi hara yang tinggi pada DBM dapat merangsang pembentukan kalus yang optimal, karena akumulasi nutrisi yang banyak akan terserap oleh kalus yang berair.
Tunas yang diperoleh pada hasil penelitian ini seluruhnya menunjukkan bentuk yang abnormal dan tidak dapat dipindahkan pada media perakaran karena tunas telah mengalami senesen setelah kurang lebih 3 bulan diinkubasi. Tunas yang
33
terbentuk memiliki daun yang abnormal seperti ujung daun meruncing, ukuran daun kecil, urat dan tulang daun tidak jelas, serta tidak memiliki batang. Senesen pada daun dimulai dari bagian pangkal daun kemudian menyebar ke seluruh bagian daun. Senesen pada daun tomat yang terbentuk adalah ditandai dengan perubahan warna daun menjadi kuning. Warna kuning merupakan indikator senesen pada banyak tanaman. Senesen terjadi akibat degradasi protein pada kloroplas, yang kemudian diikuti dengan degradasi nukleus pada tahap akhir senesen. Faktor internal penyebab senesen pada adalah umur tanaman, level hormon endogen, substansi pertumbuhan dan proses perkembangan tanaman (Gan 2004). Level hormon merupakan salah satu penyebab senesen karena hormon merupakan regulator alami tanaman yang berperan dalam mengatur pertumbuhan tanaman dari awal hingga akhir sehingga kehadirannya menentukan berjalannya proses pertumbuhan.
Auksin merupakan hormon yang berperan dalam pembentukan jaringan vaskular pada tanaman. Seperti yang dijelaskan Aloni (2004) bahwa secara alami auksin yang disintesis pada ujung primordia daun akan berdifusi secara terus menerus sehingga membentuk saluran yang membentuk jaringan vaskular. Produksi auksin pada ujung daun mengendalikan pembentukan pembuluh pada daun yaitu urat dan tulang daun, dimana bagian ujung daun adalah lokasi utama sintesis auksin.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa jaringan mesofil pada tunas yang terbentuk tidak sempurna begitu juga urat dan tulang daun. Hal ini mengindikasikan tidak bekerjanya sintesis maupun transportasi auksin secara normal. Konsentrasi auksin sangat menentukan kinerjanya, sehingga konsentrasi yang tepat akan mendukung pertumbuhan yang optimal. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut perlu mengkaji zat pengatur tumbuh yang dapat mengarahkan pertumbuhan yang normal, yaitu melalui pengujian kombinasi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang tepat. Akhir penelitian ini adalah diperoleh tunas-tunas abnormal hasil kultur antera yang diduga bersifat haploid berdasarkan morfologi tunas yang terbentuk dan pengamatan jumlah stomata serta susunan jaringan palisade daun.