Pichia pastoris Sebagai Organisme
6. Integrasi gen multikopi
mirip dengan urutan konsensus ragi yaitu 5′-TTTTTATA. DNA kemudian dire-sintesis untuk membuang urutan
konsensus ini, meningkatkan kodon bias dan
meningkatkan kandungan GC. Setelah perubahan ini mRNA ditemukan dalam ukuran yang utuh (Scorer et al., 1993). Translasi mRNA dipengaruhi oleh daerah yang tidak ditranslasi pada sisi 5′. Urutan konsensus yang mengawali translasi pada ragi seperti P. pastoris berbeda dengan organisme lain seperti mamalia. Urutan konsensus pada ragi adalah A/YAA/UAAUGUCU (Romanos et al., 1992). Urutan pre-pro MF adalah optimal untuk ragi seperti S. cerevisiase atau P. pastoris, tapi bila sinyal sekresi natif digunakan maka inisiasi translasi mungkin perlu diubah.
6. Integrasi gen multikopi
Untuk mengoptimumkan ekspresi protein, sering melibatkan isolasi galur yang mengandung kaset ekspresi multikopi. Biasanya menyeleksi transforman yang mengandung integrasi multikopi lebih disukai karena klon seperti ini mempunyai potensi untuk mengekspresikan protein rekombinan dengan level yang tinggi. Manfaat lebih lanjut dari seleksi transforman yang mengandung gen multikopi adalah jika terdapat mutasi pada salah satu kopi kaset ekspresi, yang terjadi selama proses integrasi, kemudian protein yang dihasilkan oleh kopi mutan ini
69
mungkin tidak akan berkontribusi terhadap jumlah total protein yang diekspresikan (Eckart & Bussineau, 1996).
Integrasi multi kopi terjadi relatif jarang dengan laju 1-10 persen (Chen et al., 2000). Jumlah kopi integran kaset ekspresi dapat memengaruhi jumlah protein yang diekspresikan oleh P. pastoris. Contohnya peningkatan jumlah integran kaset ekspresi (jumlah kopi) dari 1-14 untuk protein fragmen C toksin tetanus meningkatkan level ekspresi protein 6 kali (Clare et al., 1991). Dengan cara yang sama 20 kopi integrasi dari tumor necrosis
factor (TNF- ) menghasilkan peningkatan ekspresi
sampai 200 kali (Sreekrishna et al., 1989), 19 kopi integran dari mEGF meningkatkan level protein 13 kali dan level protein antigen permukaan hepatitis B dilaporkan meningkat 11,5 kali dengan 8 kopi integran (Vassileva et al., 2001).
Lebih penting lagi, walaupun dengan dosis gen tinggi, tidak terdapat bukti terjadinya kejenuhan jalur sekresi (Clare et al., 1991), dengan masing-masing peristiwa integrasi ditemukan berkontribusi sebanding dengan jumlah protein yang diekspresikan. Hal ini menunjukkan bahwa tidak terjadinya kompetisi pada setiap vektor (Vassileva et al., 2001), dan menyarankan bahwa multi-integrasi mempunyai sedikit pengaruh terhadap ekspresi dan sekresi protein dalam P. pastoris.
70
Tiga pendekatan dilakukan untuk mendapatkan galur P. pastoris multikopi. Pendekatan pertama melibatkan konstruksi vektor dengan multi-head-to-tail dari kaset ekspresi (Brierley, 1998). Kunci untuk mendapatkan konstruksi ini adalah vektor yang memiliki kaset ekspresi yang diapit oleh sisi restriksi yang memiliki ujung komplemen (seperti kombinasi BamH1-BglII,
Sal1-XhoI). Proses pengulangan pemotongan dan re-insersi
akan menghasilkan sejumlah vektor yang mengandung peningkatan jumlah kaset ekspresi. Manfaat dari metode ini adalah terutama pada produksi produk farmasi untuk manusia, di mana jumlah kaset ekspresi diketahui dengan tepat dan dapat ditentukan kembali untuk verifikasi melalui penentuan urutan DNA.
Metode kedua menggunakan vektor ekspresi yang mengandung gen HIS4 P. pastoris dan gen Tn903kanr bakteri. Gen resistan kanamycin bakteri juga mengubah resistensi terhadap antibiotik eukariota G418 (Scorer et
al., 1994). Level resistensi G418 akan berhubungan
dengan jumlah kopi. P. pastoris pertama harus ditransformasi dengan His prototropi; kemudian transforman multikopi di tapis dengan replica-plating pada petri yang mengandung G418. Metode ini akan menghasilkan sejumlah koloni yang mengandung vektor ekspresi multikopi. Bagaimanapun jumlah kopi vektor bervariasi, sehingga sejumlah besar transforman (50-100
71
koloni harus dianalisis jumlah kopi dan level ekspresinya. Dengan pendekatan ini galur yang membawa lebih dari 30 kopi kaset ekspresi telah diisolasi (Clare et al., 1991).
Pendekatan ketiga untuk konstruksi galur multikopi melibatkan penggunaan vektor yang memiliki gen Sh ble bakteri yang mengubah resistensi terhadap antibiotik zeocin (Gambar 4.8) (Higgins et al., 1998).
Gambar 4.8. Insersi sisi 5’ plasmid ke lokus AOX1 (pada
galur Mut+), sehingga menambahkan PAOX1, gen yang dikloning dan gen resistan terhadap zeocin ke genom P. pastoris. Insersi multikopi dapat terjadi karena insersi gen pada locus AOX1 atau aox1::ARG4 terjadi beberapa kali (Invitrogen, 2006).
72
Tidak seperti seleksi G418, galur yang
ditransformasi dengan kaset ekspresi yang mengandung marker zeocin dapat diseleksi langsung berdasarkan resistensi terhadap obat. Resistensi terhadap zeocin konsentrasi tinggi menyebabkan klon dapat diseleksi untuk integrasi multikopi, karena produk gen Sh ble terikat dan menginaktifkan zeocin dengan cara yang tergantung pada dosis (Monsalve et al., 1999; Vassileva et
al., 2001; Chen et al., 2000). Sehingga jumlah populasi transforman galur multikopi dapat ditapis dengan menumbuhkannya pada media seleksi yang mengandung zeocin dengan konsentrasi yang meningkat. Juga, karena gen Sh ble dapat bertindak sebagai marker seleksi pada bakteri dan ragi, maka vektor ekspresi ini menyenangkan untuk digunakan. Bagaimanapun, sama seperti seleksi dengan G418, kebanyakan transforman yang resistan terhadap zeocin konsentrasi tinggi tidak mengandung vektor multikopi sehingga sejumlah transforman harus diseleksi. Galur yang mengandung multikopi insersi dapat dideteksi dengan analisis dot blot kuantitatif dan analisis Southern Blot.
Contohnya pada studi yang dilakukan oleh Vassileva et al (2001), pengaruh seleksi terhadap hiper-resistensi terhadap zeocin dengan konsentrasi 100, 500, 1000 dan 2000 mg/mL diuji dengan transforman yang akan dianalisis jumlah kopi gen terintegrasinya. Ditemukan bahwa transforman yang resisten terhadap
73
zeocin 100 mg/mL pada umumnya mengandung satu kopi, yang resistan terhadap zeocin 500 mg/mL mengandung dua kopi, yang resistan terhadap zeocin 1000 mg/mL mengandung tiga kopi dan transforman yang resistan terhadap zeocin 2000 mg/mL mengandung empat kopi integran (Vassileva et al., 2001). Sebaliknya, studi lain yang dilakukan oleh Sarramegna et al (2002) menemukan bahwa transforman yang resisten terhadap zeocin 1000 mg/mL mengandung integran 15-25 kopi. 7. Ekspresi intraselular
Bila mengekspresikan protein rekombinan dalam ragi, perlu dipertimbangkan apakah protein tersebut akan diekspresikan intraselular atau sekresi ekstraselular. Pilihan akan tergantung pada protein yang akan diekspresikan. Jika target protein tidak disekresikan menggunakan sistem natif, maka induksi protein melewati sistem sekresi mungkin akan menghasilkan protein yang telah diubah oleh glikosilasi atau protein yang kekurangan modifikasi pasca-translasi yang mungkin sangat diperlukan. Sehingga ekspresi intraselular merupakan pilihan lain dari sekresi dan biasanya tidak menghasilkan glikosilasi, yang dalam beberapa kasus menyediakan beberapa metode yang lebih disukai. Namun purifikasi protein hasil ekspresi intraselular dapat menjadi lebih sulit dibanding protein yang disekresikan, karena protein target
74
biasanya hanya mencapai 1 persen dari total protein intraselular (Rees et al., 1999).
Manfaat dari ekspresi protein rekombinan intraselular dalam P. pastoris adalah tidak seperti protein yang diekspresikan E. coli, umumnya residu amino terminal metionin dipotong oleh metionin amino-peptidase (Romanos et al., 1992). Efisiensi pemotongan ini meningkat bila asam amino kedua adalah prolin, valin atau cystein (Sreekrishna et al., 1989). Amino terminal dari asam amino protein yang diekspresikan dalam P.
pastoris juga dapat di-asilasi oleh N-asetil-transferase
(Romanos et al., 1992; Rees et al., 1999).
Banyak protein yang telah sukses diproduksi dalam P. pastoris menggunakan sistem ekspresi intraselular, terutama protein membran seperti antigen permukaan hepatitis B (Vassileva et al., 2001). Fosforilasi residu serin, treonin atau tirosin merupakan modifikasi pasca-translasi yang penting untuk beberapa protein. Sistem ekspresi P. pastoris sebagai eukariota diketahui memfosforilasi beberapa protein yang memiliki sisi fosforilasi. (Zanchin & McCarthy (1995) menemukan bahwa walaupun ekspresi dari fosfoprotein eukariota yaitu faktor inisiasi 4E dalam S. cerevisiae menghasilkan fosforilasi pada sisi yang berbeda dengan protein natif (Zanchin & McCarthy, 1995), fosforilasi sering terjadi pada residu tertentu, terutama pada struktur -turn (Li et
75 al., 2001). Pelipatan protein dengan benar yang biasanya
terjadi pada sistem ekspresi ragi ini diharapkan menghasilkan fosforilasi bentuk natif. Penggunaan P.
pastoris untuk ekspresi fosfoprotein telah cukup banyak
dipelajari, sehingga sistem ini dapat digunakan untuk ekspresi fosfo-protein di masa yang akan datang.