Pichia pastoris Sebagai Organisme
2. Peptida sinyal
Protein-protein eukariota yang akan disekresikan, integrasi ke plasma membran atau bergabung dengan lisosom, akan mengalami tahapan yang sama yang dimulai di RE. Protein-protein ini memiliki urutan sinyal (peptida sinyal) yang fungsinya pertama kali ditemukan oleh Gunter Blobel dan kolega pada tahun 1970. Peptida sinyal berfungsi mengarahkan translokasi protein ke tujuan akhirnya di dalam sel. Pada beberapa protein, peptida sinyal dipotong dari protein selama dalam perjalanan atau setelah protein sampai di tujuan akhir (Nelson and Cox, 2000).
Peptida sinyal yang berada pada ujung N polipeptida yang baru disintesis merupakan urutan yang berfungsi mengarahkan translokasi protein melewati membran menuju lumen RE. Panjang urutan sinyal bervariasi antara 13-36 residu asam amino dan pada umumnya mengandung 9-12 residu hidrofobik. Satu atau lebih residu asam amino yang bermuatan positif yang biasanya berada sebelum daerah hidrofobik, dan urutan pendek yang relatif polar pada ujung C (dekat sisi
108
pemotongan) yang mengandung asam amino dengan rantai samping yang pendek (terutama Alanin) pada posisi yang paling dekat dengan sisi pemotongan.
Peptida sinyal tersusun dari tiga domain yaitu : ujung amino yang bermuatan positif (N region), daerah non-polar dan hidrofobik (H region), dan daerah yang lebih polar yang merupakan daerah pemotongan dan dekat dengan ujung karboksil peptida sinyal (C region). Domain N pada umumnya bermuatan positif, karena adanya residu lisin atau arginin. Pada beberapa kasus, kehadiran residu lisin atau arginin dapat meningkatkan kecepatan translokasi. Domain N memiliki beberapa fungsi, di antaranya ikut terlibat dalam mengarahkan preprotein (protein yang belum matang karena masih mengandung peptida sinyal) ke translokase. Domain N dapat berikatan dengan permukaan membran lipid bilayer yang bermuatan negatif. Apabila jumlah muatan positifnya berkurang, maka dapat menyebabkan interaksi yang kurang efisien dengan membran lipid. Namun hal ini dapat diimbangi dengan kenaikan hidrofobisitas pada H
region. Muatan positif pada domain N juga diduga
mengorientasikan peptida sinyal dari protein sekresi sampai ke lipid bilayer dengan tepat (Fekkes and Driessen, 1999).
Daerah hidrofobik atau domain H dari suatu peptida sinyal panjangnya bervariasi antara 9 – 12 asam
109
amino. Domain H merupakan bagian paling penting dari peptida sinyal. Pada kebanyakan kasus, hidrofobisitas total dari domain H menentukan efisiensi translokasi. Efisiensi translokasi meningkat dengan bertambahnya panjang dan hidrofobisitas domain H. Residu-residu asam amino yang terdapat pada domain H berperan pada pembentukan konformasi α-heliks yang memanjang dari domain N. Kadang-kadang kehadiran pemecah heliks (helix breaker) seperti residu glisin atau prolin yang terdapat pada posisi tengah domain H dapat menyebabkan peptida sinyal membentuk struktur seperti benang tipis (hairpin-like), sehingga peptida sinyal dapat masuk ke lipid bilayer (Fekkes and Driessen, 1999).
Peptida sinyal memiliki sisi pemotongan yang terdapat pada daerah C atau domain C. Sisi pemotongan spesifik hanya terdapat pada domain C. Biasanya sisi pemotongan terdapat pada residu-residu seperti alanin, glisin, serin, dan threonin dan yang paling umum adalah alanin. Peptida sinyal hanya dapat dipotong oleh enzim yang spesifik yaitu signal peptidase (Fekkes and Driessen, 1999).
Urutan sinyal pada umumnya membentuk
konformasi -heliks. Jika urutan ini cukup hidrofobik, namun tidak terlalu panjang, maka setelah keluar dari ribosom urutan sinyal akan dikenali oleh signal
110
menghentikan elongasi translasi beberapa saat untuk mempertahankan panjang dari rantai polipeptida yang baru disintesis sebelum diinsersikan ke pori translokasi (1). Kompleks yang terbentuk, yaitu kompleks RNC-SRP (RNC= ribosome nascent chain) kemudian akan diarahkan menuju ke SR (SRP- Receptor) yang terdapat pada membran RE. SRP akan berinteraksi dengan SR dengan bantuan GTP (2). Kemudian RNC akan dimasukkan ke translokon (protein translokator/Sec61) yang juga terikat ke membran (3). Kemudian urutan sinyal akan dibebaskan dari SRP, GTP dihidrolisis dan diikuti dengan disosiasi kompleks SRP-SR, dan translasi dilanjutkan sampai selesai (4) (Egea, et al. 2005). Akhirnya signal peptidase memotong signal peptida, membebaskan protein ke dalam RE.
Besarnya interaksi antara SRP dengan urutan sinyal berhubungan dengan efisiensi translokasi ((Valent
et al., 1995) karena protein dengan urutan sinyal yang
lebih hidrofobik ditranslokasikan dengan lebih efisien (Doud et al., 1993). Yamamoto et al. (1987) melaporkan peningkatan sekresi lisozim manusia oleh S. cerevisiae melalui penambahan jumlah residu hidrofobik pada urutan sinyal. Di samping itu, informasi yang dikode oleh domain hidrofobik urutan sinyal juga memengaruhi waktu dan efisiensi pematangan protein, yaitu glikosilasi dan pemotongan urutan sinyal. Proses pematangan ini
111
dikontrol oleh interaksi antara urutan sinyal dan translokon (Rutkowski et al., 2003).
Gambar 6.3. Mekanisme translokasi protein (Egea, et al. 2005).
Seleksi peptida sinyal
Dalam rangka mengarahkan protein ke jalur sekresi, diperlukan urutan sinyal tertentu. Seperti telah diuraikan sebelumnya, urutan sinyal biasanya merupakan amino terminal pendek yang disebut urutan pre yang pada umumnya mengandung daerah amino terminal yang bermuatan yang diikuti oleh sejumlah residu hidrofobik
112
dan sisi pengenal pemotongan enzim signal peptidase. Urutan sinyal ini memediasi translokasi ko-translasi ke retikulum endoplasma dan dibuang oleh signal peptidase selama translokasi (Paifer et al., 1994; Romanos et al., 1992).
Protein yang diekspresikan oleh P. pastoris dapat diproduksi intra atau ekstraseluler. Karena ragi ini hanya menyekresikan protein endogen dengan level rendah, maka protein heterolog yang disekresikan akan merupakan bagian utama total protein dalam medium. Sehingga dengan mengarahkan protein heterolog ke medium kultur dapat berperan sebagai tahapan awal pemurnian protein. Bagaimanapun, karena kestabilan protein dan kebutuhan folding, pemilihan sekresi biasanya berperan pada protein asing yang normalnya disekresikan oleh inang natifnya. Dalam beberapa kasus, peneliti memanfaatkan kaset ekspresi yang dibuat dan disediakan oleh Invitrogen. Dengan menggunakan vektor P. pastoris tertentu, peneliti dapat mengkloning gen asing in frame dengan urutan yang mengode signal natif , pre-pro-peptida -mating factor dari S. cerevisiase atau urutan signal dari asam fosfatase P. pastoris (Cereghino dan Cregg, 2000).
Walaupun beberapa urutan peptida sinyal yang berbeda, termasuk peptida sinyal natif yang terdapat pada protein heterolog telah sukses digunakan, namun hasil
113
yang diperoleh sangat bervariasi. Urutan sinyal pre-pro
-mating factor S. cerevisiae merupakan urutan sinyal
yang sering digunakan untuk menginduksi Sec61p yang memediasi translokasi protein ke retikulum endoplasma
P. pastoris (http://faculty.kgi.edu/cregg/), dan memberikan hasil yang bagus. Urutan signal ini terdiri dari 19 asam amino urutan sinyal (pre sequence) yang diikuti oleh 70 residu urutan pro (pro sequence) yang mengandung tiga konsensus sisi glikosilasi ikatan-N dan dua sisi pemprosesan endopeptidase. Selama proses sekresi -mating factor dari S. cerevisiae, peptida sinyal dihilangkan melalui dua proses pemotongan enzim (Gambar 5.4). Enzim Kex2 memotong secara spesifik setelah residu lisin-arginin, kemudian Ste13 memotong pengulangan asam glutamat-alanin (EAEA) untuk menghasilkan protein -mating faktor (Gambar 6.4).
Enzim-enzim protease yang sama juga terdapat di P.
pastoris (Brake et al., 1984). Efisiensi proses pemotongan
dapat dihentikan oleh urutan asam amino di sekeliling sisi pemotongan. Contohnya efisiensi pemotongan Kex2 dan protein Ste13 dapat dipengaruhi oleh posisi residu prolin. Selanjutnya struktur tersier yang dibentuk oleh protein asing mungkin dapat memproteksi pemotongan oleh protease.
114
Gambar 6.4. Jalur sekresi protein pada S. cerevisiae.
Terlihat sisi pemotongan pre-region oleh signal peptidase, pro-region oleh endoprotease Kex2, dan spacer peptida oleh peptidil endopeptidase (Ste13) (Ostergaard et al., 2000).
Pada beberapa kasus, urutan sinyal -mating factor merupakan sinyal sekresi yang lebih baik
dibandingkan urutan pemula dari protein heterolog natif. Namun pada beberapa penelitian lain sinyal sekresi -mating factor atau PHO1 tidak dapat bekerja, sehingga
digunakan sinyal sintetik. Martinez-Ruiz et. al (1998), melakukan mutasi pada urutan pemula (leader) natif untuk mengonstruksi motif pengenalan Kex2p (Lys-Arg) yang lebih efisien. Cara ini membantu sekresi protein
K-115
sarcin (untuk inaktivasi ribosom) dari Aspergilus
giganteus. Solusi yang lebih drastis adalah dengan
merancang urutan leader prepro yang semuanya sintetik. Untuk ekspresi insulin manusia, ditemukan bahwa leader sintetik dan urutan spacer sintetik dapat meningkatkan sekresi dan jumlah protein yang dihasilkan (Kjeldsen et
al., 1999).
Pemilihan ini dapat dilakukan berdasarkan sinyal sekresi natif (jika ada), urutan pemula pre-pro -mating
factor S. cerevisiae ( -MF), urutan sinyal asam fosfatase
(PHO) atau urutan sinyal invertase (SUC2) (Li et al., 2001). Urutan sinyal yang paling sering digunakan pada sistem sekresi P. pastoris adalah urutan pemula pre-pro
-mating factor ( -MF). Urutan sinyal ini terdiri dari 19
asam amino peptida sinyal (pre-sekuen), diikuti oleh 60 asam amino daerah pro. Biasanya daerah pro akan dipotong oleh endopeptidase. Ketika translasi sedang berlangsung, urutan sinyal akan dibuang oleh sinyal peptidase dan sisi pemotongan daerah pro dikenali oleh protease ragi yaitu kex2, sehingga akan menghasilkan pembebasan protein matang yang sudah diproses (Raemaekers et al., 1999). Sisi pemotongan kex2p dapat juga mengandung dua perulangan Glu-Ala pada bagian C terminal sisi pemotongan untuk meningkatkan aktivitas kex2p. Perulangan Glu-Ala kemudian dapat dibuang dari
116 mature protein oleh diaminopeptidase yang merupakan
produk gen ste 13.
Seperti telah dijelaskan sebelumnya, ragi seperti S.
cerevisiae mempunyai kebutuhan akan kespesifikan yang
rendah terhadap pengenalan urutan sinyal, dan begitu juga dengan P. pastoris. Banyak protein rekombinan yang telah sukses diekspresikan dalam P. pastoris
menggunakan urutan sinyal natif. Sebagai contoh, ekspresi dan sekresi domain ekstraselular reseptor activin dalam P. pastoris telah sukses dilakukan menggunakan urutan sinyal natif dan -MF; namun, produk dari ekspresi menggunakan urutan sinyal natif ditemukan lebih aktif secara biologi (Daly et al., 2004). Sehingga tidak ada cara yang pasti untuk menentukan apakah urutan sinyal natif akan menghasilkan sekresi karena tingkat keberhasilannya sangat bervariasi (Sleep et al., 1990; Tuite et al., 1999; Zsebo et al., 1986).
Ekspresi dan sekresi phytohaemagglutinin (PHA) merupakan salah satu contoh di mana peptida sinyal natif (PHA-E) menghasilkan protein yang disekresikan, dengan
folding yang tepat dan asam amino terminal yang diproses
dengan tepat (Raemaekers et al., 1999). Bila dibandingkan dengan sekresi PHA dengan menggunakan peptida sinyal -MF, maka penggunaan peptida sinyal PHA-E hanya menghasilkan sekresi sedikit protein
117
pemprosesan amino terminal yang berbeda (Leuking et
al., 2000). Signal peptida hasil rekayasa yang kaya leucin
(CLY-L8) yang dirancang berdasarkan urutan peptida sinyal natif (CLY) telah digunakan untuk menghasilkan level ekspresi sekresi lisozim manusia 2 kali lebih tinggi dibandingkan peptida sinyal CLY natif (Yamamato et al., 1987). Kedua peptida sinyal ini telah digunakan untuk mengekspresikan dan menyekresikan lisozim manusia dalam P. pastoris dan dibandingkan dengan pola sekresi
yang diperoleh bila menggunakan -MF. -MF
ditemukan menyekresikan 20 kali lebih tinggi dibandingkan peptida sinyal CLY atau CLY-L8 (yang menghasilkan sekresi kurang lebih sama besar) (Oka et
al., 1999).
Studi ekspresi lisozim yang lain menemukan bahwa peptida sinyal natif lisozim ulat sutra menyekresikan lebih tinggi dibandingkan peptida sinyal natif lisozim manusia dalam P. pastoris. Sehingga peptida sinyal natif lisozim ulat sutra dihipotesiskan meningkatkan sekresi lisozim manusia dalam P. pastoris. Namun, ditemukan tidak terjadi peningkatan level sekresi. Berlawanan dengan penggunaan peptida sinyal lain, urutan pre-pro peptida sinyal -MF telah digunakan secara ekstensif dalam sistem ekspresi P. pastoris dengan tingkat keberhasilan yang tinggi. Beberapa protein
118
rekombinan yang telah diproduksi menggunakan sistem ini disimpulkan pada Tabel 6.1.
Sebelumnya, peptida sinyal SUC2 telah digunakan untuk ekspresi protein hibrida interferon manusia (Chang
et al., 1986). Studi yang membandingkan kemampuan
sinyal natif dan peptida sinyal SUC2 untuk
menyekresikan -amilase ditemukan bahwa sinyal SUC2 menyekresikan dengan lebih efisien (level sekresi 95 persen) dibandingkan peptida sinyal natif (level sekresi 75 persen) dari protein yang ditranslasi (Paifer et al., 1994). Signal peptida SUC2 juga telah digunakan untuk studi sekresi -1-antitripsin, tapi hanya 20 persen dari protein yang disekresikan (Moir et al., 1987).
Tabel 6.1. Protein rekombinan yang diekspresikan dan disekresikan menggunakan peptida sinyal -MF
Protein Referensi
Reseptor aktivin ACTRIIa/b domain ekstraselular
Antigen SAG1 Toxoplasma gondii Protein ghilanten antikoagulan-antimetastatik
Chicken Cystatin
Ovine follicle stimulating hormone a-Lactalbumin
rat mast cell protease 7 human lewis fucosiltransferase Olive pollen allergen Ole e
Daly et al., 2004 Biemans et al., 1998 Brankamp et al., 1995 Jiang et al., 2002 Fidler et al., 1998 Saito et al., 2002 Lawson et al., 2002 Gallet et al., 1998 Huecas et al., 1999
119
HLA-DR2 mulekul Human type III procolagen Beta- lactoglobulin Insulin
Trichoderma reesei 1,2-a-D-mannosidase Influenza neuraminidase
Aplysia ADP-ribosyl cyclase Murine antibody
Marsupial growth factor Soybean root nodule fosfat Human fibroblast kolagen Beta subunit of bovine follicle Human MU-opioid receptor
Bovine enterokinase catalitik subunit Alfa-N-asetilgalaktosaminidase Kalandadze et al., 1996 Keizer-Gunnink et al.,2000 Kim et al., 1997 Kjeldsen et al., 1999 Maras et al., 2000 Martinet et al., 1997 Munshi & Lee, 1997 Ogunjimi et al., 1999 Fidler et al., 2002 Penheiter et al., 1998 Rosenfeld et al., 1996 Samaddar et al., 1997 Talmont et al., 1996 Vozza et al., 1996 Zhu et al., 1996
Peptida sinyal asam fosfatase (PHO) (Payne et al.,
1995), juga telah sukses digunakan untuk
mengekspresikan reseptor serotonin tikus (5-HT5A) (Weiss et al., 1995) dan pepsinogen porcine (Yoshimasu
et al., 2002), namun protein lain yang diekspresikan dan
disekresikan menggunakan PHO menghasilkan
pemprosesan amino terminal yang tidak tepat (Odonohue
et al., 1996). Vektor pHIL-S1 mengandung signal asam
fosfatase dan digunakan untuk mengekspresikan midkine manusia. Ditemukan bahwa peptida sinyal PHO ini menghasilkan sekresi 100 kali lebih rendah dibandingkan peptida sinyal -MF dan 8 kali lebih rendah dibandingkan peptida sinyal natif midkine manusia (Murasugi et al., 2001). Untuk meningkatkan pemprosesan amino terminal,
120
perubahan sinyal PHO yang mengandung sisi
pemotongan Kex2p hasil rekayasa telah dikembangkan dan ditemukan meningkatkan pemprosesan peptida antikoagulan kutu (Laroche et al., 1994).
Pemprosesan -MF pre-pro leader sekuen
Urutan sinyal -MF sudah banyak digunakan, namun belum pernah ada studi yang membandingkannya dengan urutan sinyal lain. Selain itu pemprosesan pro-peptida yang dimediasi oleh Kex2p/Ste13p pada S.
cerevisiae sering menimbulkan masalah pada Pichia,
sehingga menghasilkan asam amino non-natif pada sisi N terminal protein heterolog (De Schutter et al., 2009).
Struktur -MF terdiri dari 19 asam amino pre-sekuen peptida sinyal dan 60 asam amino hidrofilik daerah pro (Julius et al., 1984; Brake et al., 1984). Urutan peptida sinyal bertanggung jawab terhadap translokasi pro-protein ke dalam RE dan diikuti dengan pemotongan oleh signal peptidase selama proses translokasi. Selanjutnya pro-protein ditranspor ke Golgi di mana daerah pro dipotong oleh aminopeptidase dua basa, yaitu kex2 protease (kex2p) untuk membebaskan protein matang. Kex2p merupakan protein membrane tipe I, yang berlokasi di kompartemen late Golgi. Kex2p merupakan protease serin (Henkel et al., 1999; Rockwell et al., 1998), anggota dari pro hormon famili konvertase dan
121
disintesis sebagai pre-proenzim (Powner et al., 1998) yang membutuhkan aktivasi untuk mematangkan enzim melalui autokatalisis (Davey et al., 1998). Kex2p mengenali pasangan residu asam amino basa seperti Lys-Arg atau Lys-Arg-Lys-Arg (Davey et al., 1998; Smeekens, 1993; Henkel, 1999). Selanjutnya terjadi juga pemotongan amino terminal yaitu perulangan residu Glu-Ala di dalam Golgi oleh produk gen ste 13 (ste13p). Ste13p berlokasi pada tempat yang sama dengan Kex2p yaitu di late Golgi dan merupakan dipeptidil aminopeptidase tipe IV (Li et
al., 2001; Davey et al., 1998).
Peran perulangan Glu-Ala dan sisi pemotongan Kex2p
Walaupun pre-pro- MF telah digunakan secara ekstensif, terdapat beberapa contoh di mana aplikasinya
menimbulkan masalah. Alasan utamanya adalah
terdapatnya insersi ulangan dipeptida Glu-Ala antara amino-terminal protein rekombinan dan sisi pemotongan Kex2p. Walaupun ulangan Glu-Ala meningkatkan jumlah materi/protein yang dipotong dengan mencegah halangan sterik dari sisi pemotongan kex2p (Sreekrishna et al., 1997), kehadirannya menghasilkan pembentukan protein rekombinan dengan perpanjangan amino-terminal Glu-Ala. Hal ini dapat menyebabkan cacat ujung N-terminal karena terjadinya pemprosesan amino-terminal yang
122
berbeda karena tidak mampu-nya ste3p untuk memproses sejumlah besar protein rekombinan yang diproduksi (Brake et al., 1984). Contoh sejumlah protein rekombinan yang telah diekspresikan dengan perpanjangan amino-terminal Glu-Ala terdapat pada tabel 6.2.
Tabel 6.2. Protein rekombinan yang diekspresikan
dengan perpanjangan Glu-Ala
Protein Referensi
Phaseolus vulgaris agglutinin Lisozin insek
Venom allergen antigen 5 Herring antifreeze protein Antifungal protein Psd1 Bovine beta-laktoglobulin Phytohaemagglutinin Raemaekers et al., 1999 Koganesawa et al., 2001 Monsalve et al., 1999 Li et al., 2001 Almeida et al., 2001 Kim et al., 1997 Raemaekers et al., 1999
Terdapatnya perpanjangan amino terminal
dipeptida ini tidak diinginkan untuk aplikasi beberapa protein rekombinan. Ulangan Glu-Ala antara protein matang dan kex2p dapat dihilangkan pada proses kloning dalam rangka untuk memperoleh amino terminal yang lebih autentik. Namun, penghilangan ulangan Glu-Ala dapat menurunkan efisiensi kespesifikan pemotongan Kex2p. Pada kasus ini sekresi pro-protein produk pemotongan yang memiliki perpanjangan amino-terminal
123
yang panjang, yang merupakan 9-11 asam amino dari daerah pro -MF telah diobservasi (Henkel et al., 1999). Selain itu, jika pemprosesan selanjutnya terhalang, pro-protein kemudian disekresikan ke dalam medium kultur dalam keadaan utuh dan sangat terglikosilasi (Julius et al., 1984).
Ulangan Glu-Ala yang tidak terpotong pada sisi amino-terminal juga dapat menyebabkan masalah lain dalam hal struktur dan fungsi protein. Contohnya ekspresi lisozim telah memperlihatkan bahwa termostabilitas yang dinyatakan sebagai dari temperatur pada saat titik tengah transisi denaturasi termal (TM) menurun tajam bila protein mengandung ulangan Glu-Ala. Rendahnya level ekspresi yang diobservasi pada lisozim juga menyebabkan penurunan stabilitas, menyebabkan protein dengan ulangan Glu-Ala lebih rentan terhadap protease intraselular (Koganesawa et al., 2001).
Ulangan Glu-Ala juga dapat memengaruhi immunogenisitas protein rekombinan. Sehingga ekspresi dari protein antigen 5 dari yellow-jacket (Vespula
vulgaris) dan paper wasp (Polistes annularis) dalam P. pastoris yang mempunyai perpanjangan amino-terminal
ulangan Glu-Ala, mempunyai epitop imunogenik yang baru yang tidak terdapat pada venom allergen natif. Dalam kasus ini ulangan Glu-Ala daerah amino terminal
124
menjadi sisi imunogenik yang dominan (Monsalve et al., 1999).