HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Perairan Tawar
Dari hasil isolasi usus ikan Nila dengan didapat 8 isolat berbeda secara morfologi koloni. Penelitian ini juga mengujikan sebanyak 13 isolat yang diisolasi oleh Mayasari dan Rulia (komunikasi pribadi tim kerja) yang terdiri dari 5 isolat air kolam ikan serta 8 isolat sedimen kolam ikan. Pengamatan karakteristik morfologi isolat BAL, pewarnaan Gram serta uji katalase disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Pengamatan karakteristik bakteri asam laktat sumber isolasi usus ikan (US), air kolam (AK) dan sedimen kolam (EK) pada media MRSA selama waktu inkubasi 48 jam Kode Isolat Karakteristik Morfologi Penataan sel Katalase Warna koloni
Bentuk koloni Tepi koloni Elevasi
US1 putih susu bergelombang tidak teratur timbul kokus -
US2 putih susu bulat siliat berbukit kokus -
US3 bening bulat halus datar kokus -
US4 putih susu bulat timbul gunung kokus -
US5 putih susu bulat tidak teratur gunung kokus -
US6 putih susu bulat halus timbul kokus -
US7 krem filiform lobat umbonat kokus -
US8 putih susu berfilamen bergelombang berbukit kokus -
AK1 putih susu bulat tidak teratur timbul kokus -
AK2 putih susu menyebar
tidak teratur
gelombang datar
kokus -
AK3 krem bulat tepi
timbul
tidak teratur timbul
kokus -
AK4 bening melebar
permukaan kisut
halus timbul
basil -
AK5 putih susu bulat tepi
timbul
halus timbul
basil -
EK2 putih susu permukaan
kusut
halus timbul basil -
EK4 Putih bulat halus timbul kokus -
EK6 putih susu bentuk-I bergelombang timbul basil -
EK7 putih susu berfilamen lobat berbukit basil -
EK8 putih susu bulat halus datar basil -
EK9 putih susu filiform siliat krateriform basil -
EK10 putih susu berfilamen bergelombang berbukit basil -
EK11 krem bulat tepi
timbul
halus gunung
kokus -
Dari hasil yang diperoleh karakteristik morfologi koloni yang tumbuh pada media MRSA bervariasi, dengan bentuk kokus maupun basil, bentuk, tepi dan elevasi bervariasi, warna koloni dari putih hingga krem serta keseluruhan uji katalase menunjukkan hasil negative (Tabel 2). Pewarnaan Gram menunjukkan bahwa hasil isolat tergolong bakteri Gram positif. Media MRSA lazim digunakan pada isolasi BAL karena media tersebut menyediakan sumber nitrogen yang cukup bagi pertumbuhan serta mendukung aktivitas metabolisme BAL dalam menghasilkan senyawa antimikroba (Kim et al. 2006).
4.2 Seleksi BAL Potensial
Sebanyak 21 isolat bakteri asam laktat diuji antagonis dengan metode Banerjee et
al. (1999). Zona hambat yang terbentuk terhadap A. hydrophila selama waktu
inkubasi 48 jam pada media MHA (Mueler Hinton Agar) diukur berdasarkan kemampuan isolat BAL membentuk zona bening penghambatan pada agar dengan kepadatan sel awal A. hydrophila dengan mengukur OD0,5
Tabel 3. Rata-rata zona hambat isolat BAL terhadap A. hydrophila pada media MHA pada suhu 28
pada panjang gelombang 600 nm. Data penghambatan tersebut secara lengkap disajikan dalam Tabel 3.
o
Kode isolat
C dan waktu inkubasi 48 jam Rata-rata zona hambat (mm) Kode isolat Rata-rata zona hambat (mm)
Kode isolat Rata-rata zona
hambat (mm)
US1 0 EK2 0 AK1 0
US2 4,0 EK4 7,0 AK2 0
US3 0 EK6 0 AK3 0
US4 17,6 EK7 0 AK4 0
US5 0 EK8 0 AK5 0
US6 13,3 EK9 0
US7 0 EK10 5,5
US8 0 EK11 0
Berdasarkan besar zona hambat (Tabel 2) terdapat lima isolat BAL yang memiliki kemampuan dalam menghambat patogen uji A. hydrophila. Tiga isolat dari usus ikan Nila (Oreochromis niloticus) dengan kode US2, US4 dan US6 dengan kategori baik hingga kuat serta dua isolat bersumber sedimen kolam ikan
mengkategorikan zona bening dengan diameter hambat 0-3 mm tergolong kategori penghambatan lemah, diameter hambat 3-6 mm dengan kategori baik sedangkan diameter hambat lebih besar dari 6 mm tergolong kategori kuat. Keasaman sitoplasma dipertahankan pada awal pertumbuhan sel, sehingga semua protein dan enzim yang berada di dalam sel dapat tetap bekerja secara optimal. Isolat mampu melakukan transport aktif pengeluaran proton sehingga nutrisi masih dapat ditranspor dan isolat dapat tumbuh. Tiap isolat memiliki fase pertumbuhan yang berbeda sesuai dengan spesiesnya. Perbedaan waktu isolat dalam mencapai fase kematian terkait dengan ketidakseimbangan pengeluaran dan pemasukan proton. Senyawa antibakteri akan terhenti dihasilkan ketika isolat memasuki fase ini. Keadaan ini memungkinkan bakteri uji untuk bertahan hidup dan zona bening menjadi kecil (Mayasari dkk, 2013). Menurut Hosoya et al. (1998) menyatakan bahwa sel bakteri cenderung menghasilkan senyawa antimikroba jika ada pengaruh patogen lain yang mengancam di sekitarnya.
Zona bening yang terbentuk beragam, isolat US2, US4, EK4 dan EK10 memperlihatkan pinggiran zona hambat yang kabur sedangkan isolat US6 dengan pinggiran tegas (Gambar 2). Pinggiran yang kabur diduga merupakan metabolit aktif yang bersifat menghambat pertumbuhan sel bakteri uji. Sementara itu zona hambatan dengan pinggiran yang tegas diduga isolat memiliki kemampuan menghasilkan metabolit yang bersifat bakterisidal, dimana metabolit dapat membunuh sel bakteri uji. Hal ini merupakan dasar peneliti memilih isolat US6 untuk dilanjutkan sebagai isolat terpilih meskipun daerah penghambatannya 13,3 mm lebih kecil dibanding US4 yang memiliki daerah penghambatan 17,6 mm. Sarkono dkk (2010) mengkategorikan zona bening ke dalam karakter penghambatan menghambat dan membunuh bakteri patogen. Rahayu dkk (2004) menyatakan bahwa sifat bakterisidal merupakan kemampuan yang diharapkan dari bakteri probiotik sehingga dapat mengendalikan pertumbuhan bakteri patogen dalam aplikasinya.
Gambar 2. Zona hambat isolat BAL terhadap A. hydrophila kategori baik hingga kuat, US2 = zona tegas ; US4 = zona kabur ; US6 = zona tegas; EK4 = zona tegas ; EK10 = zona
kabur) pada suhu 28 oC, media MHA dan masa inkubasi 48 jam.
Berdasarkan luas diameter zona hambat dipilih tiga isolat sumber usus dan dua isolat sumber sedimen air kolam yang potensial menghambat patogen A.
hydrophila. Dari hasil diatas dapat diasumsikan adanya potensi agen probiotik
dari sumber isolasi usus ikan Nila dan sedimen kolam ikan. Isolasi dari sumber yang sama dalam upaya seleksi probiotik dengan memaksimalkan kemampuan adaptasi BAL pada kondisi perairan dalam aktivitas penghambatan bakteri target
A. hydrophila. Rengpipat et al. (2003) menyatakan probiotik dari habitat aslinya
memiliki peluang hidup dan tumbuh yang lebih besar dibandingkan kompetitor asing dari luar sistem. Isolat yang paling potensial untuk dilanjutkan sebagai agen pengendali biofilm A. hydrophila adalah isolat dari sumber isolasi usus ikan Nila US6 dengan kriteria zona hambat yang tinggi. Isolat dari sumber isolasi usus lebih potensial dibandingkan dengan isolat sumber lainnya. Gutowska et al. (2004) menyatakan mikrobiota usus memiliki aktivitas antagonis terhadap banyak patogen ikan serta melindungi dari infeksi patogen.
Potensi sel BAL terkait dengan kemampuan melekat dan membentuk koloni sebagai suatu prasyarat sebagai bakteri probiotik. Hal ini didukung oleh Verschuere et al. (2000) yang mengelompokkan kemampuan probiotik yaitu 1) bersifat antagonis terhadap patogen, 2) Pelekatan atau lokasi hidup dari bakteri merupakan salah satu yang terpenting dalam kriteria seleksi bakteri probiotik karena hal ini termasuk dalam prasyarat pembentukan suatu koloni.