HASIL DAN PEMBAHASAN
E. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Uji
Proses isolasi tahap I dilakukan terhadap 4 biakan bakteri yang tumbuh dari 4 apusan darah jerawat yang berbeda. Pemisahan koloni biakan dilakukan dengan melihat bentuk dan warna koloninya. Masing-masing koloni yang tumbuh diisolasi pada media NA menggunakan metode streak dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Pada isolasi tahap I diperoleh biakan 10 koloni bakteri. Hasil dari biakan 10 koloni bakteri yang diperoleh, selanjutnya dibuat stok dalam bentuk agar miring menggunakan media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Sepuluh stok bakteri yang diperoleh dari isolasi tahap I dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Sepuluh stok bakteri hasil isolasi tahap I
Langkah selanjutnya adalah melakukan pengecatan Gram terhadap 10 stok bakteri yang diperoleh untuk mengidentifikasi morfologi dan jenis Gram bakteri yang telah diisolasi. Proses pengecatan Gram menggunakan 4 macam cat. Cat Gram A yang terdiri dari kristal violet, alkohol dan amonium oksalat berfungsi sebagai pewarna primer. Cat Gram B yang terdiri dari iodium, kalium iodida dan akuades berfungsi sebagai penguat warna. Cat Gram C yang terdiri dari aseton dan alkohol berfungsi sebagai peluntur. Cat Gram D yang terdiri dari safranin, alkohol dan akuades berfungsi sebagai pewarna kontras atau pembeda (Pelczar & Chan,1988).
Pengecatan Gram atau pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pada bakteri Gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri Gram negatif berwarna merah. Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan sehingga kompleks kristal
violet-perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id49
iodin yang masuk ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida sehingga alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).
Hasil dari pengecatan Gram menunjukkan bahwa ditemukan bakteri bentuk kokus Gram positif pada tabung 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan campuran antara bakteri bentuk basil Gram positif dan bakteri bentuk basil Gram negatif pada tabung 10 seperti pada Tabel III dan Gambar 14.
Tabel III. Hasil Pengecatan Gram Koloni Bakteri yang Tumbuh dari Apusan Darah Jerawat
NO SAMPEL HASIL
1. Tabung 1 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 2. Tabung 2 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 3. Tabung 3 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 4. Tabung 4 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 5. Tabung 5 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 6. Tabung 6 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 7. Tabung 7 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 8. Tabung 8 Diketemukan bakteri CoccusGram (+) 9. Tabung 9 Diketemukan bakteri CoccusGram (+)
10. Tabung 10 a. Diketemukan bakteri batang (Bacillus) Gram (+) b. Diketemukan bakteri batang (Bacillus) Gram (-)
(A) (B)
(C) (D)
Gambar 14. (A) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 1-9. (B) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 1-9. (C) Pertumbuhan koloni bakteri nomor 10.
(D) Hasil pengecatan stok bakteri tabung 10.
Stok bakteri pada tabung 1 sampai 9 dapat langsung digunakan untuk uji aktivitas antibakteri karena hanya terdapat 1 koloni bakteri di dalamnya. Sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, stok bakteri pada tabung nomor 1 sampai 9 harus di-refresh atau diregenerasi terlebih dahulu menggunakan media TSA (Tryptone Soya Agar) dalam bentuk agar miring. Digunakan media TSA untuk membuat stok bakteri bentuk kokus Gram positif sebelum digunakan untuk uji karena bakteri ini lebih tumbuh subur pada media TSA daripada pada media NA (Gentry, D., et.al, 2000). Regenerasi ini bertujuan untuk memperbanyak jumlah bakteri yang digunakan sebagai bahan uji dan stok serta untuk mencegah bakteri mati selama penyimpanan.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id51
Proses isolasi tahap II dilakukan terhadap stok bakteri dalam tabung 10 sehingga didapatkan koloni bakteri bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif yang terpisah. Proses ini diawali dengan memindahkan campuran antara bakteri bentuk basil Gram positif dan bentuk basil Gram negatif pada tabung 10 ke media selektif yaitu media MacConkey Agardan media Agar Darah. Media MacConkey Agar merupakan media selektif dan diferensial yang mempunyai keistimewaan memisahkan bakteri enterik Gram negatif dari campuran bakteri yang memfermentasikan laktosa, karena dalam MacConkey Agar ini terdapat laktosa, crystal violet dan neutral red bile salt. Bile salt yang terkandung dalam media ini digunakan sebagai penghambat tumbuhnya bakteri Gram positif sehingga koloni yang tumbuh pada media ini adalah koloni bakteri Gram negatif. Media Agar Darah adalah media diperkaya yang menyediakan nutrisi ekstra untuk pertumbuhan bakteri. Media Agar Darah termasuk dalam media differensial dimana dapat membedakan bakteri yang memiliki kemampuan untuk hemolisis dan tidak, yang ditandai oleh adanya zona (halo) disekitar koloni. Pertumbuhan koloni bakteri tabung 10 pada media MacConkey Agar dan media Agar Darah dapat dilihat pada Gambar 15.
(A) (B)
Gambar 15. Pertumbuhan koloni bakteri tabung 10 pada (A) media MacConkey Agar(B) media Agar Darah
Langkah selanjutnya dilakukan penggambilan koloni yang berbeda kemudian dilakukan pengecatan Gram untuk pengamatan morfologi serta sifat Gram-nya. Hasil pengecatan yang menunjukan koloni bakteri bentuk basil Gram positif dan koloni bakteri bentuk basil Gram negatif yang sudah terpisah masing-masing dibuat stok agar miring menggunakan media NA. Bakteri bentuk basil Gram positif memiliki ciri berbentuk batang dan berwarna ungu setelah dilakukan pengecatan, sedangkan bakteri bentuk basil Gram negatif memiliki ciri berbentuk batang dan berwarna merah setelah dilakukan pengecatan.
Tahap selanjutnya adalah identifikasi bakteri uji yang dilakukan melalui pengamatan bentuk dan warna koloninya serta pengamatan morfologi bakteri yang dilakukan di bawah mikroskop. Pengamatan bentuk dan warna koloni bakteri uji dilakukan secara langsung terhadap pertumbuhan bakteri pada media agar. Sedangkan pengamatan morfologi bakteri uji dilakukan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x dengan minyak imersi dengan cara mengamati bentuk, susunan dan sifat Gram bakteri setelah dilakukan pengecatan terhadap bakteri uji. Hasil identifikasi bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 16, 17 dan 18.
(A) (B) (C) Gambar 16. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk kokus Gram positif.
(B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk kokus Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk kokus Gram positif.
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id53
Gambar 16 menunjukkan ciri-ciri bakteri hasil isolasi sebagai berikut :
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
Susunan sel : bergerombol
Morfologi sel : bulat
Bentuk tepian : rata
Warna pengecatan Gram : ungu
Jenis Gram : positif
(A) (B) (C) Gambar 17. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram positif.
(B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram positif. (C) Stok bakteri bentuk basil Gram positif.
Gambar 17 menunjukkan ciri-ciri bakteri hasil isolasi sebagai berikut :
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
Susunan sel : berderet
Morfologi sel : batang
Bentuk tepian : bergelombang Warna pengecatan Gram : ungu
(A) (B) (C) Gambar 18. (A) Hasil pengecatan bakteri bentuk basil Gram negatif.
(B) Pertumbuhan koloni bakteri bentuk basil Gram negatif. (C) Stok bakteri bentuk basil Gram negatif.
Gambar 18 menunjukkan ciri-ciri bakteri hasil isolasi sebagai berikut :
Bentuk koloni : bulat
Warna koloni : krem
Susunan sel : monobasil (sel bakteri basil tunggal)
Morfologi sel : batang
Bentuk tepian : bergelombang Warna pengecatan Gram : merah
Jenis Gram : negatif