BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat kapang endofit berasal dari bagian daun tanaman Iler yang diperoleh dari Balittro, Bogor. Daun Iler yang digunakan yaitu daun muda (DIM), sedang (DIS), dan daun tua (DIT). Pemilihan berdasarkan letak daun yang diambil, yaitu daun yang berada diujung batang (daun muda), daun yang berada di bagian tengah batang (daun sedang), dan daun yang berada di pangkal batang (daun tua). Daun yang telah dipetik dicuci dengan air mengalir hingga bersih untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada permukaan daun, lalu dilakukan sterilisasi permukaan untuk menghindari kontaminan atau adanya pertumbuhan dari kapang lain yang bukan berasal dari daun tanaman Iler, sehingga diperoleh isolat kapang endofit yang berasal dari daun tanaman Iler.
Sterilisasi permukaan dilakukan dengan cara bagian daun dari tanaman Iler (Coleus atropurpureus Benth.) dicuci bersih menggunakan air mengalir, selanjutnya direndam dalam etanol 70% selama 1 menit dilanjutkan dengan larutan natrium hipoklorit 5.25% selama 5 menit dan direndam kembali dengan etanol 70% selama 30 detik, dan yang terakhir sampel dibilas menggunakan akuades steril selama 1 menit untuk menghilangkan sisa agen sterilisasi permukaan. Daun kemudian diletakkan di atas kertas saring steril hingga kering (Kalyanasundaram dkk, 2015).
Alkohol 70% memiliki mekanisme kerja mendenaturasi protein dan melarutkan lemak pada membran protein mikroba sehingga dapat merusak sel mikroba, dan natrium hipoklorit merupakan zat kimia yang termasuk golongan halogen yang akan melepaskan klor yang mampu merusak membran dan protein mikroba (Pratiwi, 2008). Alkohol 70% dan Natrium hipoklorit 5.25% yang digunakan bertujuan untuk dekontaminasi permukaan daun dan merupakan kombinasi yang sesuai karena alkohol 70% mempunyai spektrum afinitas yang relatif sempit sehingga perlu ditambahkan dengan natrium hipoklorit 5.25%. Setelah proses dekontaminasi daun dilakukan pembilasan dengan menggunakan akuades steril. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan sisa alkohol 70% dan Natrium hipoklorit 5.25% yang masih menempel pada daun Iler yang dapat mengganggu pertumbuhan kapang endofit.
Daun yang sudah steril selanjutnya dipotong dengan ukuran 1x1 cm2 menggunakan pisau bedah steril, setiap 1 cawan petri yang berisi media PDA
ditanami dua potongan daun dengan posisi bersebrangan. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang (27-29⁰C) selama 5-21 hari (Rustanti, 2007).
Media PDA merupakan media umum yang digunakan untuk menumbuhkan kapang endofit sebagai media isolasi, dan media pemurnian kapang endofit. Media
PDA juga kaya akan nutrisi yang mudah dicerna sehingga memudahkan pertumbuhan kapang endofit (Ariyono dkk., 2014). Kontrol yang digunakan adalah akuades steril dari bilasan terakhir proses sterilisasi permukaan. Adanya kontrol diperlukan untuk menguji keefektifan sterilisasi permukaan, jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba pada kontrol maka proses sterilisasi berlangsung sempurna dan kapang yang diisolasi merupakan kapang endofit yang berasal dari tanaman Iler (Coleus atropurpureus Benth.).
Setelah proses inkubasi, kapang endofit yang tumbuh pada sekitar daun dimurnikan dengan menggunakan metode streak plate pada media PDA yang baru untuk memperoleh biakan kapang endofit yang murni. Biakan kapang endofit kemudian diinokulasikan ke media PDA miring di dalam tabung reaksi yang digunakan sebagai stock culture dan working culture. Hasil isolasi diperoleh sebanyak 6 isolat kapang endofit dengan menggunakan kode DIM1A, DIS1A,
DIS2A, DIT1A, DIT1B, dan DIT3A. Hasil isolasi kapang endofit dapat dilihat pada lampiran 13.
4.3 Identifikasi Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan pada penelitian diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi IPB, Bogor. Untuk mengetahui kemurnian bakteri uji yang digunakan setelah proses peremajaan kembali, maka dilakukan identifikasi secara makroskopik dan mikroskopik. Identifikasi secara makroskopik dilakukan dengan cara pengamatan warna koloni dan permukaan koloni bakteri. Identifikasi secara mikroskopik dilakukan dengan pewarnaan Gram, pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x.
Tabel 4.3 Hasil Identifikasi Bakteri uji secara Makroskopik dan Mikroskopik No. Bakteri uji Ciri makroskopik Ciri mikroskopik
1. Staphylococcus aureus ATCC 27853 Koloni berwarna kuning keemasan, mengkilap, dan permukaannya rata.
Sel bakteri berbentuk bulat bergerombol seperti anggur,
berwarna ungu
dengan pewarnaan Gram (Gram positif). 2. Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Koloni berwarna putih, berlendir dan permukaannya rata.
Sel bakteri berbentuk batang lurus atau
lengkung dan
berwarna merah
dengan pewarnaan
Gram (Gram
Gambar 4.3 Hasil Pengamatan secara Mikroskopik dengan perbesaran 100x (Dokumentasi pribadi)
(A) Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 27853 (B) Bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Pada metode pewarnaan Gram zat warna yang digunakan adalah larutan kristal violet dan safranin yang merupakan zat warna basa. Teknik pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kaca objek dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol 70%, kemudian di teteskan dengan NaCl 0,9%, lalu bakteri uji diinokulasikan sebanyak 1 ose pada kaca objek tersebut dan lakukan fiksasi di atas api bunsen. Kaca objek yang sudah berisi bakteri diteteskan dengan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Kristal violet dapat mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut dengan pewarna primer.
Preparat bakteri kemudian dibilas dengan air mengalir, selanjutnya preparat dengan diteteskan dengan cairan lugol dan didiamkan selama 45-60 detik sehingga membentuk kompleks kristal violet-lugol yang memberikan warna ungu tua pada sel bakteri. Preparat selanjutnya dibilas kembali menggunakan air mengalir, kemudian preparat ditetesi dengan alkohol 96% yang memiliki fungsi sebagai
decolorizing agent (senyawa peluntur warna) dan didiamkan selama 30 detik. Alkohol 96% dapat menyebabkan pori-pori sel bakteri Gram positif menciut sehingga ikatan komplek antara kristal violet-lugol yang terbentuk sebelumnya tidak dapat keluar dari sel dan sel bakteri tetap berwarna ungu tua, Sedangkan pada bakteri Gram negatif lapisan lipid pada dinding sel akan terekstraksi yang menyebabkan kompleks kristal violet-lugol dapat keluar dari sel dan warna ungu tua pada sel memudar. Preparat selanjutnya dibilas kembali menggunakan air mengalir.
Preparat kemudian diwarnai dengan safranin dan didiamkan selama 1-2 menit (Pelczar and Chan, 1986). Sel bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam bakteri Gram positif, dan sel bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam bakteri Gram negatif (Pratiwi, 2008).
Media NA merupakan media yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji. Media NA adalah media yang umum digunakan untuk membiakkan nonfastidious
mikroorganisme, yaitu mikroorganisme yang tidak membutuhkan nutrisi dan kondisi khusus untuk tumbuh (Arulanantham dkk., 2012). Media NA mengandung pepton, ekstrak daging, dan agar. Pepton merupakan sumber nitrogen organik utama dan ekstrak daging mengandung sebstansi jaringan hewan yang dapat terlarut dalam air (Pelczar and Chan, 1986), kedua komponen ini merupakan nutrisi untuk pertumbuhan bakteri.
4.4 Seleksi Isolat Kapang Endofit Penghasil Antibakteri
Pada uji ini dilakukan skrining isolat kapang endofit yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 27853 dan
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Data hasil uji seleksi kapang endofit dapat dilihat pada tabel 4.4.
Tabel 4.4 Hasil Uji Seleksi Kapang Endofit
No. Isolat Zona hambat (mm) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1. DIM1A (-) 5,1 mm 2. DIS1A 6,7 mm (-) 3. DIS2A 5,25 mm (-) 4. DIT1A (-) 6,1 mm 5. DIT1B (-) (-) 6. DIT3A 6,1 mm 6,1 mm Keterangan:
Proses seleksi kapang endofit ini merupakan skrining awal untuk melihat aktivitas antibakteri kapang endofit. Uji ini dilakukan dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Methode). Isolat murni kapang dengan usia 14 hari diambil menggunakan sedotan steril atau cork borer dengan diameter 6 mm dan dipindahkan pada media MHA yang berisi bakteri uji, selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari. Hasil positif dari seleksi kapang endofit yang memiliki aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan adanya zona hambat yang terbentuk disekitar kapang endofit (Elfina dkk., 2014). Gambar hasil uji seleksi kapang Endofit dapat dilihat pada pada lampiran 14.
Berdasarkan tabel 4.4 hasil uji seleksi kapang endofit pada 6 isolat kapang endofit yang berhasil diisolasi hanya 5 isolat yang memiliki zona hambat, yaitu Isolat DIM1A, DIS1A, DIS2A, DIT1A, dan DIT3A. Isolat DIS1A dan DIS2A memiliki zona hambat terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram positif), isolat DIM1A dan DIT1A memiliki zona hambat terhadap bakteri uji Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Gram negatif), dan isolat DIT3A memiliki zona hambat terhadap kedua bakteri uji. Sedangkan isolat DIT1B tidak memiliki zona hambat terhadap ke dua bakteri uji.
Isolat DIM1A dan DIS1A memiliki zona hambat < 6 mm, sementara sedotan steril yang digunakan untuk membuat bulatan pada kapang endofit memiliki diameter 6 mm. Hal ini disebabkan oleh proses pengambilan kapang endofit menggunakan sedotan steril sulit dilakukuan karena tekstur kapang endofit yang alot untuk diambil menggunakan sedotan steril sehingga bagian tepi menjadi tidak rata.
Berdasarkan data yang diperoleh bahwa isolat DIS1A dan DIS2A memiliki kemampuan penghambatan pertumbuhan selektif terhadap bakteri uji
Staphylococcus aureus ATCC 25923, isolat DIM1A dan DIT1A memiliki kemampuan penghambatan pertumbuhan selektif terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, dan isolat DIT3A memiliki kemampuan penghambatan pertumbuhan terhadap kedua bakteri uji. Isolat DIT3A dapat dikatakan sebagai
Broad-Spectrum antibiotic, yaitu antibotik yang mampu menghambat pertumbuhan secara luas baik bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh senyawa antibakteri yang terkandung di dalam isolat kapang
endofit memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Faktor yang mempengaruhi kemampuan senyawa antibakteri dalam menghambat pertumbuhan bakteri adalah komposisi dari struktur dinding sel bakteri. Menurut Pelczar & Chan (1986) bakteri Gram negatif mengandung lipid dengan persentase lebih tinggi dari pada yang dikandung bakteri Gram positif, sehingga sistem pertahanan pada bakteri Gram negatif lebih kompleks dan sulit untuk ditembus oleh senyawa antibakteri.
