4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.5 Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi BPH Tuna (Thunnus sp)
Isolasi merupakan pemisahan mikroba tertentu dari populasi campuran. Proses isolasi dilakukan terhadap tiga koloni terpilih yang berwarna ungu atau biru pada media Niven didasarkan pada Niven et al. (1981), Kung et al. (2009),
35
dan Hwang et al. (2010). Koloni berwarna ungu kemudian digoreskan dengan
metode gores kuadran pada media TSA hingga menghasilkan koloni tunggal. Karakterisasi bakteri bertujuan untuk mengetahui karakteristik tiap isolat yang dihasilkan dan memudahkan dalam pemilihan jenis API kit yang akan digunakan. Sebelum dilakukan uji karakterisasi, dilakukan terlebih dahulu analisis histamin yang dihasilkan bakteri. Isolat murni yang diperoleh ditumbuhkan dalam media TSBH, kemudian kadar histamin yang dihasilkan bakteri tersebut dianalisis. Analisis histamin isolat bakteri bertujuan untuk meyakinkan bahwa koloni yang dihasilkan merupakan koloni BPH karena tidak semua bakteri yang tumbuh pada Niven adalah penghasil histamin (Kim et al. 2002), hanya sebesar 33% (Hwang et al. 2010) dan 29,16% (Joshi & Bhoir 2011).
Hasil analisis histamin isolat murni menunjukkan bahwa ketiga isolat menghasilkan histamin sebesar (i) 1,2077 ppm pada isolat 1; (ii) 1,2802 ppm pada isolat 2; dan (iii) 1,8617 ppm pada isolat 3. Oleh karena itu, dapat diketahui bahwa ketiga isolat tersebut menghasilkan enzim hdc. Selanjutnya, uji karakteristik bakteri dilakukan terhadap ketiga isolat yang telah dinyatakan positif penghasil histamin. Hasil pengujian tersebut dapat dilihat pada Tabel 9.
Hasil pewarnaan Gram yang terlihat pada Gambar 5 menunjukkan bahwa ketiga isolat merupakan bakteri Gram negatif dengan penampakan sel berwarna merah muda. Uji karakterisasi berikutnya pada ketiga isolat adalah pergerakan bakteri (motilitas), yang menunjukkan bahwa semua bakteri dari ketiga isolat bersifat non motil. Hal ini dapat dilihat dari pertumbuhannya yang tidak menyebar pada agar semisolid. Oleh karena itu, bakteri tersebut tidak memiliki flagela sebagai alat gerak (Pelczar dan Chan 2006).
Oksidase merupakan enzim yang termasuk dalam sistem transpor elektron bakteri aerob. Uji oksidase penting dilakukan untuk mengidentifikasi
Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, dan sebagainya. Ketiga jenis bakteri
tersebut bersifat oksidase positif, sedangkan anggota dari Enterobacteriaceae
bersifat oksidase negatif (Tiwari et al. 2009). Selain itu, uji oksidase penting dilakukan untuk mengetahui jenis API kit yang digunakan untuk identifikasi. Hasil pengujian oksidase menunjukkan bahwa isolat 1 dan 2 bersifat oksidase positif, sedangkan isolat 3 bersifat oksidase negatif. Oksidase positif menandakan
bahwa bakteri menghasilkan energi melalui respirasi, sedangkan oksidase negatif menandakan bahwa bakteri menghasilkan energi melalui proses fermentasi.
Tabel 9 Morfologi koloni dan morfologi sel bakteri
Sifat isolat 1 2 3
Morfologi koloni
Warna pada Niven Ungu Ungu Ungu
Warna pada TSA Kuning Kuning Kuning
Bentuk koloni Tidak beraturan Tidak beraturan Bulat
Tepian Berombak Berombak Penuh
Elevasi Cembung Cembung Cembung
Morfologi sel
Bentuk sel Batang Batang Batang
Gram Negatif Negatif Negatif
Motilitas Negatif Negatif Negatif
Isolat 1 Isolat 2
Isolat 3
Gambar 5 Bentuk sel dan hasil pewarnaan Gram isolat 1, 2, dan 3
Uji katalase bertujuan mengetahui kemampuan mikroba untuk menghasilkan katalase. Katalase berperan sebagai pendegradasi H2O2 yang
dihasilkan oleh oksidase. Selama respirasi, banyak mikroba menghasilkan H2O2
37
metabolit tersebut dapat bersifat racun, sehingga harus diinaktif secara enzimatis. Katalase mengubah H2O2 menjadi oksigen dan air (Tiwari et al. 2009).
Berdasarkan uji katalase terhadap ketiga isolat, diketahui bahwa ketiga isolat tersebut bersifat katalase positif, maka isolat tersebut bersifat aerob atau anaerob fakultatif.
Identifikasi bakteri merupakan perbandingan antara sifat bakteri yang belum teridentifikasi dengan sifat bakteri sesuai dengan kunci identifikasi bakteri. Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara konservatif melalui pengujian berbagai macam gula yang kemudian hasil reaksi gula tersebut dicocokkan dengan panduan buku manual untuk mencari genus dari isolat bakteri. Buku manual yang dapat digunakan adalah Bergey’s Manual. Selain itu, terdapat cara yang lebih mudah dan cepat untuk mengidentifikasi bakteri, yakni menggunakan kit, seperti
analytical profile index (API).
Analytical profile index (API) merupakan suatu sistem yang dapat menentukan reaksi isolat murni terhadap berbagai jenis media diagnosa yang dipilih secara hati-hati. Keuntungan penggunaan sistem tersebut adalah hanya membutuhkan sedikit media, tidak menggunakan banyak tempat dalam inkubator, dan memberikan makna yang efektif serta dapat dipercaya terhadap hasil identifikasi (Black 2004).
Berdasarkan hasil uji oksidase dan pewarnaan Gram memperlihatkan bahwa jenis API yang digunakan dan berhasil mengidentifikasi ketiga isolat adalah API 20 NE untuk isolat 1 dan 2 serta API 20 E untuk isolat 3. API 20 NE digunakan untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif, berbentuk batang, dan nonfermenter (Lampe & Reijden 1984), sedangkan API 20 E digunakan untuk mengidentifikasi bakteri Enterobacteriaceae (Popovic et al. 2007). Hasil
identifikasi bakteri isolat dapat dilihat pada Tabel 10 dan Tabel 11. Software API kit yang berperan dalam membaca hasil menyatakan bahwa isolat 1 dan 2 adalah bakteri jenis Pseudomonas putida dengan persentase identifikasi berturut-turut 99,6% dan 99,7% atau dianggap sebagai very good identification, sedangkan isolat 3 adalah bakteri Raoultella ornithinolytica dengan persentase identifikasi
Hasil ini sejalan dengan hasil uji histamin terhadap isolat, bahwa ketiga bakteri tersebut merupakan BPH. Kanki et al. (2002), Wauters et al. (2004), Kung et al. (2009), menyatakan bahwa Raoultella ornithinolytica adalah salah satu dari
jenis Enterobacteriaceae yang berperan sebagai BPH. Demikian juga dengan Sato et al. (1994) yang menyatakan bahwa Pseudomonas putida juga merupakan BPH
dan bakteri pendekomposisi histamin.
Tabel 10 Hasil pembacaan API kit 20 NE
Pengujian Bahan aktif Hasil Isolat 1 Isolat 2
(-) (+) (-) (+) (-) (+) NO3 Potassium nitrate Tidak berubah
warna
Merah tua √ √
TRP L-triptophane Tidak berubah warna
Jingga √ √
GLU D-glucose Biru Kuning √ √
ADH L-arginine Kuning Jingga √ √
URE Urea Kuning Merah muda √ √
ESC Esculin ferric citrate
Tidak berubah warna
Hitam √ √
GEL Gelatin Tidak berubah warna Hitam √ √ PNPG 4-nitrophenyl-βD- galactophyranoside Tidak berubah warna Kuning √ √
GLU D-glucose Jernih Keruh √ √
ARA L-arabinose Jernih Keruh √ √
MNE D-mannose Jernih Keruh √ √
MAN D-mannitol Jernih Keruh √ √
NAG N-acetyl- glucosamine
Jernih Keruh √ √
MAL D-maltose Jernih Keruh √ √
GNT Potassium gluconate
Jernih Keruh √ √
CAP Capric acid Jernih Keruh √ √
ADI Adipic acid Jernih Keruh √ √
MLT Malic acid Jernih Keruh √ √
CIT Trisodium citrate Jernih Keruh √ √
39
Tabel 11 Hasil pembacaan API kit 20 E
Pengujian Bahan aktif Hasil Isolat 3
(-) (+) (-) (+) ONPG 2-nitrophenyl-βD- galactophyranoside Tidak berubah warna Kuning √
ADH L-arginine Kuning Merah √
LDC L-lysine Kuning Oranye √
ODC L-ornithine Kuning Merah √
CIT Trisodium citrate Kuning Biru tua √
H2S Sodium thiosulfate Tidak berubah warna
Hitam √
URE Urea Kuning Merah muda √
TDA L-tryptophane Kuning Hitam √
IND L-tryptophane Kuning Merah √
VP Sodium pyruvate Jernih Jernih
kemerahmudaan
√ GEL Gelatin Tidak berubah
warna
Hitam √
GLU D-glucose Biru Kuning √
MAN D-mannitol Biru Kuning √
INO Inositol Biru Kuning √
SOR D-sorbitol Biru Kuning √
RHA L-rhamnose Biru Kuning √
SAC D-saccharose Biru Kuning √
MEL D-melibiose Biru Kuning √
AMY Amygdaline Biru Kuning √