DAFTAR LAMPIRAN
A. Ubi Jalar (Ipomoea batatas L.)
2. Isolasi oligosakarida
Isolasi oligosakarida dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu berdasarkan tingkat kemurniannya di dalam larutan atau media tertentu menggunakan prinsip presipitasi dan ekstraksi, pemisahan kromatografi serta konsentrasi dan kristalisasi (Pazur, 1970). Namun, metode yang paling dasar dan masih relevan untuk berbagai jenis oligosakarida sampai saat ini adalah kromatografi. Beberapa metode kromatografi yang dapat digunakan untuk isolasi adalah kromatografi kolom, filtrasi gel, lapis tipis dan kertas. Metode yang digunakan di dalam penelitian ini adalah kromatografi kertas dan HPLC untuk mengkonfirmasi hasil kromatografi kertas.
Kromatografi kertas merupakan satu-satunya cara yang tersedia sampai saat ini untuk mendapatkan komponen-komponen oligosakarida dalam bentuk murni (Pazur, 1970). Prinsip kerjanya hampir sama dengan kromatografi kolom, yaitu berdasarkan perbedaan koefisien partisi (Rf)
berbagai macam jenis oligosakarida di dalam berbagai macam jenis pelarut. Horowitz (1980) menyatakan bahwa nilai Rf sebuah komponen didefinisikan sebagai rasio jarak yang ditempuh oleh komponen dengan jarak yang ditempuh fase pelarut.
Ada dua macam fase di dalam teknik ini, yaitu fase stasioner atau diam dan fase bergerak. Komponen yang akan dikromatografi harus didistribusikan diantara kedua fase tersebut, Fase yang kaya air umumnya akan tetap diam sedangkan fase yang kaya pelarut organik akan bergerak dan membawa komponen yang dipisahkan tersebut. Sampel ditaruh pada garis dasar yang digambar di salah satu sisi kertas kromatografi (bentuk sampel dapat berupa lingkaran kecil atau garis panjang) dan pelarut organik akan memisahkan komponen-komponen oligosakarida di dalam sampel tersebut berdasarkan prinsip kapilaritas. Chamber kromatografi harus ditutup untuk mempertahankan suhu ruangan yang stabil. Arah gerak pelarut yang sering digunakan adalah ke arah atas atau menurun. Komponen-komponen dengan nilai koefisien partisi hampir sama akan sulit terpisah sedangkan komponen- komponen yang memiliki selisih nilai koefisien partisi besar akan lebih mudah dipisahkan.
Nilai Rf gula akan meningkat seiring dengan meningkatnya kandungan air di fase bergerak (Horowitz, 1980). Hal ini dikarenakan gula sangat mudah terhidrasi di dalam larutan aqueous. Horowitz (1980) juga menyatakan bahwa nilai Rf sangat dipengaruhi oleh konfigurasi gugus hidroksil gula. Nilai Rf berhubungan dengan interaksi antara gugus hidroksil dari gula melalui ikatan hidrogennya dengan air sebagai fase diam. Jumlah gugus hidroksil ekuatorial yang semakin tinggi akan menghasilkan nilai Rf gula yang semakin kecil. Hal ini dikarenakan rendahnya kelarutan gula di dalam pelarut organik sebagai fase bergerak. Dua jenis kombinasi sistem pelarut yang dapat digunakan untuk mengisolasi oligosakarida dengan kromatografi kertas adalah: 1) butil alkohol – piridin – benzena – air (5:3:1:3); dan 2) propil alkohol - etil asetat - air (7:1:2) (Horowitz, 1980).
C. Prebiotik
Saluran pencernaan manusia dihuni oleh bakteri dalam jumlah tinggi, yaitu sekitar 1012 per gram berat kering dari kandungan mikroflora di saluran pencernaan (Salminen et al., 1998). Karbon dan energi, yang diperlukan untuk mempertahankan koloni bakteri yang besar tersebut, diambil dari karbohidrat yang disekresikan inangnya atau dari karbohidrat yang dimakan inangnya dan tidak dicerna di usus kecil. Bifidobakteria dan laktobasili adalah contoh bakteri anaerobik anggota mikroflora kolon yang dapat memberikan efek menguntungkan bagi inangnya.
Gibson dan Roberfroid (1995) menyatakan bahwa prebiotik adalah bahan makanan yang tidak dapat dicerna dan menguntungkan inangnya dan menstimulasi secara selektif pertumbuhan dan atau aktivitas dari satu atau sejumlah bakteri di kolon sehingga dapat meningkatkan kesehatan. Sebuah bahan makanan agar dapat dikategorikan sebagai prebiotik harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:
1. Bahan makanan harus tidak dapat dihidrolisasi atau diserap di bagian atas saluran gastrointestinal.
2. Bahan makanan harus dapat menstimulasi secara selektif pertumbuhan bakteri yang menguntungkan di kolon.
3. Bahan makanan dapat menekan pertumbuhan patogen dan virus, menginduksi efek sistemik sehingga dapat memberikan pengaruh baik bagi kesehatan manusia.
Suatu bahan pangan dapat mengandung oligosakarida yang tidak dapat dicerna, contohnya rafinosa, fruktooligosakarida (FOS), galaktooligosakarida (GOS), galaktosillaktosa, isomaltooligosakarida atau transgalaktooligosakarida (TOS) dan palatinosa (Salminen et al., 1998). Becker et al. (1974) menyatakan bahwa contoh oligosakarida yang terdapat di ubi jalar mentah adalah stakiosa, rafinosa dan verbaskosa. Menurut Palmer (1982), kandungan oligosakarida di ubi jalar sangat rendah sedangkan menurut Collins dan Walter (1985), kandungan oligosakarida yang tidak dapat dicerna seperti rafinosa akan dapat menurunkan timbulnya penyakit kanker usus,
diabetes, penyakit hati dan penyakit saluran pencernaan. Komposisi proksimat ubi jalar mentah dapat dilihat pada Tabel 2.2 dan kandungan rafinosa dalam ubi jalar yang telah dimasak dapat dilihat pada Tabel 2.3.
Tabel 2.2. Komposisi proksimat ubi jalar mentah per 100 gram
Komponen Komposisi Energi Air Karbohidrat Total lemak Protein Serat Ampas 118 Kkal 69.60 gram 27.89 gram 0.17 gram 1.53 gram 4.1 gram 0.82 gram Sumber: Riana (2000)
Tabel 2.3. Komposisi gula terlarut dalam ubi jalar yang telah dimasak Jenis Gula (karbohidrat) % (berat basah)
Maltosa 5.5 Sukrosa 4.4 Fruktosa 0.9 Glukosa 0.8 Rafinosa 0.5 Total 12.1 Sumber: Palmer (1982)
Rafinosa adalah salah satu jenis oligosakarida yang dapat dimurnikan dari beberapa tanaman dan tidak dapat dicerna di dalam saluran pencernaan manusia. Oligosakarida jenis ini merupakan trisakarida yang terdiri dari monomer fruktosa, galaktosa dan glukosa dengan titik leleh 78oC (Pazur, 1970). Selain dapat dieskstrak dari gula bit, rafinosa juga dikenal terdapat di dalam ubi jalar menurut Palmer (1982), namun belum ditemukannya penelitian yang menganalisa kandungan rafinosa dan jenis-jenis oligosakarida
lainnya di dalam ubi jalar mentah. Struktur kimia rafinosa dapat dilihat pada Gambar 2.1.
Gambar 2.1. Struktur kimia rafinosa [β-D-Fruktofuranosil O-α-D- Galaktopiranosil-(1-6)-α-D-Glukopiranosida]
(Pazur, 1970)
Beberapa bakteri usus dapat menggunakan rafinosa untuk pertumbuhannya. Menurut penelitian Benno dan rekannya (Salminen et al., 1998), pemberian 15 gram rafinosa per hari selama 4 minggu telah meningkatkan jumlah Bifidobakteria di feses manusia secara signifikan. Rafinosa dapat dimetabolisme oleh mikroflora usus sehingga dihasilkannya asam laktat, asam asetat, asam butirat, hidrogen peroksida, bakteriosin dan metabolit lainnya (Mishra dan Lambert, 1996).
Serat pangan atau dietary fibre juga termasuk sebagai prebiotik dan banyak terdapat di bahan pangan terutama sayur-sayuran dan buah-buahan. Menurut Riana (2000), serat pangan juga terdapat di dalam ubi jalar kukus sebesar 4.1 gram. Jenis serat pangan yang dapat difermentasi oleh mikroba di saluran pencernaan adalah serat pangan larut air (soluble dietary fiber). Substrat ini dapat menyerap air di usus sehingga mengembang (bulky) dan dapat difermentasi oleh mikroflora-mikroflora di saluran pencernaan manusia sehingga menghasilkan gas-gas selain asam lemak volatil. Gas-gas tersebut adalah H2, CO2, H2O, O2 dan CH4. Sebagian besar gas tersebut dihasilkan di kolon atau usus besar dimana jumlah mikrobanya 100-1000 kali lebih tinggi dibandingkan di usus kecil (Fleming dan Calloway, 1983). Namun, gas-gas yang terdapat di usus tidak semuanya merupakan hasil fermentasi. Sebagian gas-gas tersebut berasal dari udara yang ikut masuk melalui rongga mulut saat makan dan ada yang berasal dari hasil sekresi sel dinding usus dan metabolisme sel-sel tersebut.
Kondisi-kondisi yang mempengaruhi proses fermentasi substrat prebiotik adalah kondisi saluran pencernaan (aerobik, pH), substrat yang tersedia (endogenus atau berasal dari makanan) dan tingkat simbiosis antara mikroba di dalam usus. Studi yang dilakukan oleh Salyers (1979) mengenai jenis mikroba yang terdapat di feses adalah terdapatnya 5 genus mikroba yang paling banyak terdapat di kolon, yaitu Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus dan Fusobacterium. Hal ini menunjukkan bahwa fermentasi yang terjadi di kolon tidak sepenuhnya dilakukan oleh BAL namun juga oleh bakteri-bakteri lainnya yang telah disebutkan di atas.
Kondisi usus dimana terkandung gas-gas, yang telah disebutkan di atas, dalam jumlah berlebih disebut sebagai flatulensi (Anonymous, 2005). Akibatnya dapat muncul perasaan kurang nyaman di dalam usus sehingga menyebabkan penderita sering buang angin dari rektum. Namun, flatulensi bukan merupakan penyakit dan tidak berbahaya. Fleming dan Calloway (1983) menyatakan bahwa kuantitas gas-gas yang terkandung di dalam usus dapat ditentukan oleh beberapa faktor. Faktor-faktor tersebut adalah keadaan psikologis (cemas dan stres) dan jenis substrat yang dimakan. Komposisi gas ditentukan oleh sekresi endogenus, populasi mikroba dan substrat yang tersedia untuk difermentasi mikroba (endogenus atau berasal dari diet).