DAFTAR LAMPIRAN
B. Metode Percobaan
1. Pembuatan tepung ubi jalar
Setiap jenis ubi jalar putih varietas Sukuh, Jago dan ubi jalar merah klon BB 00105.10 yang berasal dari International Center Potato (CIP) –
Bogor dibagi menjadi dua bagian yang sama besar. Bagian pertama dibiarkan tetap mentah sedangkan bagian kedua dikukus pada suhu 103- 105oC selama ± 20 menit. Ubi mentah dikupas kulitnya kemudian diiris setebal ± 2 mm dengan slicer sedangkan ubi kukus dikupas kulitnya kemudian diiris dengan pisau. Irisan-irisan ubi mentah maupun kukus dikeringkan dengan oven tray bersuhu 70oC selama 2 hari atau sampai kering kemudian ditepungkan dengan Willey Mill sehingga dihasilkan tepung ubi berukuran 60 mesh. Rendemen tepung didapatkan dari hasil pembagian antara berat ubi segar setelah dicuci dengan berat tepung. Diagram alir tahap pembuatan tepung ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 3.1.
Ubi jalar (Sukuh, Jago, merah)
Tepung ubi jalar (mentah dan kukus)
Gambar 3.1. Diagram alir pembuatan tepung ubi jalar
2. Ekstraksi oligosakarida (Muchtadi, 1989)
Tepung ubi jalar ketiga varietas (mentah maupun kukus) diekstrak oligosakaridanya dengan etanol 70% (10 gram tepung / 100 ml etanol) dengan cara diaduk selama 15 jam dengan magnetic stirrer. Setelah itu,
Dikupas, diiris dengan slicer
Dikukus 103-105oC, 20 menit
Dikeringkan dengan oven tray pada suhu 70oC, 24-48 jam
ekstrak oligosakarida tersebut disaring dengan penyaring vakum kemudian diuapkan pelarutnya dengan evaporator vakum pada suhu 40oC.
Ekstrak, yang digunakan untuk analisis kromatografi kertas, diendapkan pigmennya dengan ditambahkan 0.2 ml Pb asetat jenuh kemudian disentrifuse (2000 rpm, 10 menit) dan disaring kembali supernatannya dengan kertas saring sehingga didapatkan ekstrak oligosakarida tanpa pigmen. Ekstrak, yang digunakan untuk tahap in vitro dan in vivo, langsung disentrifuse (2000 rpm, 10 menit) kemudian disaring supernatannya dengan kertas saring, disterilkan dengan membran filter 0.2 m dan disimpan di refrigerator. Diagram alir tahap ekstraksi oligosakarida ubi jalar dapat dilihat pada Gambar 3.2.
Tepung ubi jalar (mentah dan kukus)
Ekstrak oligosakarida
Gambar 3.2. Diagram alir ekstraksi oligosakarida ubi jalar
3. Separasi oligosakarida
a. Kromatografi kertas (Apriyantono et al., 1989)
Tujuan tahap analisa ini adalah mengetahui jenis–jenis dan konsentrasi komponen oligosakarida yang terdapat di ketiga jenis ekstrak ubi jalar dengan cara dibandingkan dengan standar gula. Campuran pelarut yang digunakan untuk kromatografi kertas adalah 2-propanol, etil asetat, akuades
Diekstrak dengan etanol 70%, 15 jam
Disaring dengan penyaring vakum
Diuapkan pelarut dengan evaporator vakum pada suhu 42oC
(7:1:2), gelas ukur 2 Liter bertutup sebagai chamber kromatografi dan kertas Whatman no. 1. Setiap jenis ekstrak oligosakarida ubi jalar diteteskan ke atas kertas Whatman no. 1 sebanyak 30 L membentuk spot lingkaran kecil atau garis tipis. Standar rafinosa 25%, maltosa 25%, glukosa 25%, sukrosa 25% dan fruktosa 25% juga diteteskan masing-masing sebanyak 10 L ke atas kertas. Kertas kromatografi, yang telah diteteskan ekstrak sampel dan standar gula, dimasukkan ke dalam gelas ukur sehingga sisi kertas yang terdapat spot sampel dan standar gula terendam eluen setinggi ± 1 cm. Setelah itu, gelas ukur ditutup rapat dan didiamkan selama 48 jam.
Area-area spot komponen oligosakarida, yang telah terpisah dari ekstrak ubi jalar dan standar gula, disemprot dengan larutan pewarna berupa campuran difenilamin, anilin dan aseton kemudian dipanaskan dengan oven 100oC sehingga muncul warna biru kehijauan. Area komponen oligosakarida dari ekstrak dan standar gula tersebut dipotong dengan luasan tertentu yang sama besar kemudian ditimbang beratnya dan dihitung konsentrasinya.
b. HPLC (Apriyantono et al., 1989)
Analisa High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dilakukan di Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pasca Panen Bogor. Kolom yang digunakan adalah PNH2 Microbonda Pak dengan detektor refractive index, berlaju alir 6.8 ml/menit dan digunakan metanol 80% untuk fase gerak. Standar gula yang digunakan adalah sukrosa, maltosa, rafinosa dan maltotriosa dengan konsentrasi 50 ppm. Hasilnya berupa grafik dengan peak-peak yang memiliki waktu retensi. Setiap peak menunjukkan satu jenis komponen oligosakarida. Waktu retensi dari setiap komponen dibandingkan dengan waktu retensi dari standar gula. Waktu retensi yang hampir sama menunjukkan jenis komponen yang diperkirakan sama. Perhitungan konsentrasi komponen oligosakarida dilakukan berdasarkan rumus sebagai berikut:
area sampel volume total sampel Konsentrasi = --- x konsentrasi standar x --- sampel (ppm) area standar volume injeksi sampel
4. Pengukuran Total Padatan Terlarut (TPT) (AOAC, 1995)
Ekstrak oligosakarida steril ubi jalar mentah untuk tahap in vivo diukur TPT-nya dengan metode oven vakum. Ekstrak steril dipipet sebanyak 1 ml ke atas cawan Aluminium yang telah ditimbang terlebih dahulu berat keringnya. Berat awal ekstrak juga ditimbang dahulu, setelah itu cawan berisi ekstrak dimasukkan ke dalam oven vakum dan dikeringkan selama ± 6 jam (70oC) atau sampai beratnya tetap. Setelah dioven, berat akhir ekstrak ditimbang. TPT didapatkan dari hasil bagi antara selisih berat ekstrak setelah dikeringkan dan awal dengan berat awal ekstrak. Diagram alir tahap separasi oligosakarida dan pengukuran kadar TPT dapat dilihat pada Gambar 3.3.
Ekstrak oligosakarida
Kadar dan jenis oligosakarida Kadar TPT ekstrak
Gambar 3.3. Diagram alir separasi oligosakarida dan pengukuran kadar TPT
5. Penyegaran kultur Bakteri Asam Laktat (BAL)
Media yang digunakan untuk penyegaran kultur BAL adalah MRS Broth (MRSB). Kultur BAL disegarkan dengan menambahkan 1 ml kultur BAL yang telah diawetkan ke dalam 9 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari. BAL yang telah disegarkan dapat langsung dipakai.
Dianalisa jenis dan kadar oligosakarida dengan
kromatografi kertas Dianalisa jenis dan
kadar oligosakarida dengan HPLC
Dianalisa kadar TPT dengan metode oven
6. Uji potensi prebiotik secara in vitro: stimulasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Ketiga jenis ekstrak ubi jalar diuji efektifitasnya dalam menstimulasi pertumbuhan BAL dalam menggunakan ekstrak tersebut. BAL yang digunakan adalah Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei Rhamnosus, F1 dan G3. Media yang digunakan sebagai media pertumbuhan adalah media berbasis MRSB dimana komponen gulanya diganti dengan salah satu ekstrak oligosakarida dari ubi jalar. Kontrol yang digunakan adalah MRSB yang tanpa komponen gula sedangkan standar gula yang digunakan adalah fruktosa, sukrosa, glukosa dan rafinosa.
Ekstrak steril atau standar gula ditambahkan sebanyak 1 ml (0.5% TPT) ke dalam tabung berisi 9 ml MRS basic steril secara aseptis. Setelah itu, 0.1 ml salah satu kultur BAL (1%) ditambahkan ke dalam MRSB kemudian isi tabung divorteks. Setengah bagian volume isi tabung dituangkan ke tabung reaksi lain untuk diukur absorbansi pada hari ke-0 (H0) sedangkan setengah bagian isi tabung yang masih steril diinkubasi pada 37oC selama 2 hari dan diukur absorbansi pada hari ke-2 (H2). Pengukuran absorbansi dilakukan dengan spektrofotometer pada : 600 nm. Ekstrak oligosakarida yang paling tinggi kandungan rafinosanya dan BAL yang paling dapat terstimulasi pertumbuhannya oleh ekstrak tersebut digunakan untuk pengujian tahap in vivo. Diagram alir tahap stimulasi BAL secara in vitro dapat dilihat pada Gambar 3.4.
7. Uji potensi prebiotik secara in vivo (Evanikastri, 2003)
Uji ini bertujuan untuk melihat potensi ekstrak oligosakarida Sukuh mentah sebagai prebiotik, L. casei Rhamnosus sebagai probiotik dan campuran L. casei Rhamnosus dengan ekstrak oligosakarida Sukuh mentah sebagai sinbiotik terhadap pertumbuhan total mikroba, BAL, E. coli dan Salmonella sp. di saluran pencernaan makhluk hidup. Hewan percobaan yang digunakan adalah 24 ekor tikus putih jantan galur Sprague-Dawley berumur dua bulan.
Ekstrak oligosa- karida steril Sukuh, Jago dan merah mentah
Gambar 3.4. Diagram alir uji stimulasi BAL secara in vitro Dibuat media berbasis
MRS Broth
Disubtitusi komponen gulanya dengan ekstrak oligosakarida atau standar gula (glukosa, sukrosa, fruktosa, rafinosa)
Ditambahkan setiap jenis BAL (L. casei Rhamnosus, L. casei Shirota, F1
dan G3)ke dalam setiap jenis media
Dibagi setiap tabung menjadi dua bagian
Diukur tabung bagian pertama absorbansi untuk H-0 dengan
spektrofotometer : 600 nm
Diinkubasi tabung bagian kedua pada suhu 37oC, 48 jam
Diukur absorbansi tabung bagian kedua untuk H-2 dengan spektrofotometer : 600 nm
Ekstrak oligosakarida dengan rafinosa tertinggi (Sukuh mentah) dan jenis BAL
yang terstimulasi paling baik pertumbuhannya (L. casei Rhamnosus)
Jumlah BAL di dalam kultur dihitung terlebih dahulu dengan cara menyegarkan kultur yang telah diawetkan di dalam MRSB kemudian dilakukan pengenceran yang sesuai dan pemupukan dengan metode tuang. Setelah diketahui jumlahnya, maka dapat ditentukan jumlah BAL yang diberikan selama perlakuan. Diagram alir tahap uji potensi prebiotik ekstrak oligosakarida secara in vivo dapat dilihat pada Gambar 3.5.
Ekstrak oligosakarida Sukuh mentah yang memiliki kadar rafinosa tertinggi dan L. casei Rhamnosus yang terstimulasi pertumbuhannya paling baik oleh ekstrak tersebut digunakan pada tahap pengujian ini. Tikus-tikus dibagi menjadi 4 kelompok yang masing-masing berisi 6 ekor tikus. Pengujian dilakukan dalam 3 tahap, yaitu masa adaptasi, masa perlakuan dan masa pasca perlakuan.
Pemberian ransum standar dan air minum diberikan kepada setiap tikus selama 31 hari satu kali per hari setiap hari secara ad libitum. Masa adaptasi selama 11 hari dilakukan dengan hanya memberikan ransum standar dan air minum. Pada masa perlakuan selama 10 hari, pemberian ekstrak oligosakarida, kultur BAL dan campuran sinbiotik juga diberikan sekali sehari setiap hari. Pembagian kelompok tikus untuk pemberian perlakuan adalah:
¾ Kelompok kontrol : ransum standar
¾ Kelompok prebiotik : : ekstrak oligosakarida Sukuh mentah (TPT: 14.68%)
¾ Kelompok probiotik : kultur L. casei Rhamnosus (6.5 x 108 log cfu/ml) ¾ Kelompok sinbiotik : ekstrak oligosakarida Sukuh mentah + L. casei
Rhamnosus
Masa pasca perlakuan dilakukan selama 10 hari dengan cara menghentikan pemberian ekstrak oligosakarida, kultur BAL dan sinbiotik kepada tikus. Pada masa ini, tikus-tikus hanya diberikan ransum standar dan air mineral.
Ekstrak oligosakarida Sukuh mentah dan L. casei Rhamnosus
Efektifitas pemberian ekstrak oligosa karida Sukuh mentah, L. casei Rhamnosus dan campuran sinbiotik terhadap mikroba
di saluran pencernaan tikus
Gambar 3.5. Diagram alir uji potensi prebiotik ekstrak oligosakarida secara in vivo
Disiapkan 24 ekor tikus putih galur Sprague-Dawley jantan berumur 2 bulan
Dilakukan percobaan dengan jadwal:
H 1-11 : masa adaptasi (ransum) H 12-21 : masa perlakuan
H 22-31 : masa pasca perlakuan (ransum)
Dilakukan pengukuran jumlah total mikroba, BAL dan E. coli serta Salmonella
secara kualitatif di feses tikus
Diambil sampel pada H-0, 1, 5 dan 10 perlakuan serta H-1, 5 dan 10 pasca perlakuan
Dibagi menjadi 4 kelompok: Kelompok kontrol : ransum standar
Kelompok prebiotik : ekstrak oligosakarida Sukuh mentah (TPT: 14.68%)
Kelompok probiotik : BAL (L. casei Rhamnosus: 6.5 x 108 log cfu/ml
Kelompok sinbiotik : ekstrak + BAL (Sukuh mentah dan L. casei Rhamnosus)
Persiapan Hewan Percobaan dan Pembuatan Ransum Standar
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague-Dawley berumur 2 bulan sebanyak 24 ekor, yang dibagi menjadi 4 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 6 ekor tikus. Setiap ekor tikus memiliki kandang masing-masing. Sekali sehari setiap hari selama 31 hari seluruh tikus diberikan ransum standar sebanyak 20 gram/ekor dan air minum sebanyak 50 ml secara ad libitum. Berat badan setiap tikus ditimbang dan kandang dibersihkan setiap 2 hari sekali. Ransum standar yang diberikan terdiri dari kasein, minyak jagung, vitamin, mineral mixture, selulosa, akuades dan maizena (AOAC, 1984).
Ekstrak oligosakarida steril, yang memiliki TPT 14.68%, diencerkan sehingga volumenya menjadi 1 ml dan diberikan kepada setiap tikus kelompok prebiotik setiap hari sekali sehari selama 10 hari perlakuan. Jumlah sel BAL sebanyak 6.5 x 108 log cfu/ml diberikan kepada setiap tikus kelompok probiotik satu kali per hari setiap hari selama 10 hari perlakuan. Kultur BAL tersebut disegarkan dahulu dengan MRSB selama 2 hari pada suhu 37oC kemudian sel bakterinya diendapkan dengan cara disentrifuse, diambil selnya dan dilarutkan dengan larutan fisiologis NaCl. Setiap tikus diberikan 1 ml larutan NaCl yang berisi sel BAL.
Campuran sinbiotik terbuat dari sel BAL (6.5 x 108 log cfu/ml) yang ditambahkan ke dalam ekstrak oligosakarida Sukuh mentah steril (TPT: 14.68%). Setelah itu, sebanyak 1 ml campuran sinbiotik tersebut diberikan kepada setiap ekor tikus kelompok sinbiotik satu kali per hari setiap sehari selama 10 hari perlakuan. Pemberian ekstrak steril, kultur BAL dan campuran sinbiotik kepada tikus dilakukan dengan cara disonde.
Pengambilan Sampel Feses
Sampel feses dari setiap kelompok diambil secara aseptis pada hari ke- 0, 1, 5, 10 perlakuan dan hari ke-1, 5 dan 10 pasca perlakuan dengan cara memijat perut tikus dan sampel ditampung di dalam kantong plastik steril. Sampel feses ditimbang kemudian segera dianalisa jumlah total mikroba, BAL, E. coli sedangkan analisa Salmonella dilakukan secara kualitatif.
Persiapan Sampel
Sampel feses, yang telah diketahui beratnya (gram), diambil sebanyak 0.5 gram kemudian diencerkan dengan 4.5 ml Lactose Broth (LB) dan dihancurkan dengan stomaker sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Pengenceran selanjutnya menggunakan larutan fisiologis NaCl. Persiapan sampel ini dilakukan untuk analisa total mikroba, jumlah BAL, E. coli dan Salmonella.
Analisis Mikrobiologi (AOAC, 1990) Total Mikroba
Suspensi sampel (pengenceran 10-1) dipipet sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml larutan fisiologis NaCl sehingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dengan cara yang sama dibuat pengenceran 10-3, 10-4 dan seterusnya sampai tingkat pengenceran yang sesuai (dimana diharapkan hasilnya 1-300 koloni). Pada tingkat pengenceran yang sesuai, suspensi dipipet 1 ml secara aseptik dan dipupukan ke dalam cawan steril (duplo) kemudian dituangkan PCA, digoyangkan supaya rata dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu, jumlah koloni yang ditumbuh dihitung sebagai total mikroba.
Perhitungan jumlah Escherichia coli
Suspensi sampel, dari tingkat pengenceran yang sesuai, dipipet 1 ml dan dipupukkan ke dalam cawan petri steril (duplo), dituangi EMBA dan digoyang supaya rata kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Koloni tipikal E. coli adalah koloni berwarna hijau metalik.
Perhitungan jumlah BAL
Penghitungan jumlah BAL dilakukan dengan metode tuang (sama dengan total mikroba dan E. coli) dimana suspensi sampel dari tingkat pengenceran yang sesuai dipipet 1 ml dan dipupukkan ke dalam cawan petri (duplo). Setelah itu, media MRSA dituangkan ke dalam cawan, digoyang supaya rata dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Koloni yang tumbuh dihitung.
Uji Salmonella
Suspensi sampel di dalam LB, yang telah diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam, diinkubasikan kembali pada suhu 37oC selama 24 ± 2 jam. Setelah diinkubasi, suspensi dipipet 1 ml secara aseptis ke dalam media SCB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 ± 2 jam. Apabila warna media menjadi keruh, maka dilakukan langkah selanjutnya. Sampel diambil dengan ose secara aseptis kemudian digoreskan ke media BSA dan HEA (gores kuadran) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 ± 2 jam. Setelah diinkubasi, koloni-koloni tipikal yang tumbuh pada media diamati.
Ciri-ciri koloni tipikal Salmonella pada HEA adalah warna biru kehijauan, dengan atau tanpa warna hitam di tengahnya, beberapa tampak sebagai koloni yang besar, berwarna hitam mengkilap di tengahnya atau tampak sebagai koloni yang hampir semuanya berwarna hitam (Cunniff, 1995). Pada BSA, koloni tipikal Salmonella berwarna coklat, abu-abu atau hitam dan terkadang hijau metalik. Daerah di sekeliling media biasanya berwarna coklat pada awalnya kemudian berubah hitam seiring dengan meningkatnya waktu inkubasi (Cunniff, 1995). Apabila terdapat koloni tipikal, maka dilakukan langkah selanjutnya.
Koloni tipikal Salmonella, yang tumbuh pada media, diambil dan digoreskan ke agar miring TSIA kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 ± 2 jam dengan tutup tabung yang agak dilonggarkan untuk mencegah produksi H2S berlebih. Setelah diinkubasi, perubahan-perubahan warna pada media diamati. Hasil reaksi spesies Salmonella yang positif adalah media agar berubah menjadi warna merah sebagai tanda diproduksinya senyawa basa pada goresan miring dan media agar berwarna kuning sebagai tanda diproduksinya asam di dasar tabung dengan atau tanpa produksi H2S (kehitaman pada agar) adalah warna kuning di dasar tabung (Cunniff, 1995).
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN