BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
A. Nanas
4. Isolasi
Bromelain terdapat pada tangkai, kulit, daun, buah, maupun batang dalam jumlah yang berbeda. Kandungan enzim bromelain lebih banyak pada batang namun selama ini kurang dimanfaatkan. Distribusi bromelain pada nanas tidak merata dan tergantung pada umur tanaman. Kandungan bromelain pada jaringan yang umurnya belum tua terutama yang bergetah sangat sedikit sekali
bahkan kadang-kadang tidak ada sama sekali, sedangkan bagian tengah batang mengandung bromelain lebih banyak dibandingkan bagian tepinya. Pada buah nanas, kandungan bromelain lebih banyak pada buah nanas yang masih hijau atau belum matang dibandingkan buah nanas segar yang sudah matang (Harrach, Schulze, Nuck, Grunow, dan Maurer, 1995).
Salah satu metode yang digunakan untuk mengisolasi bromelain adalah penambahan pelarut organik. Bromelain diisolasi dari bagian tanaman nanas yang sudah berupa sari buah atau perasannya dengan menambahkan pelarut organik sebagai bahan pengendap, biasa yang digunakan adalah alkohol, aseton, dan ammonium sulfat. Cara pengendapannya berbeda-beda, ada beberapa peneliti yang melakukan pengendapan dengan menambahkan larutan pada pH tertentu dan ada yang melakukan pengendapan dengan membuat kondisi pada suhu tertentu. Hasil isolasi dengan metode ini disebut dengan crude bromelain extract (Nadzirah, Zainal, Noriham, dan Normah, 2013).
C. Metode Ninhidrin
Uji kualitatif dari protein dilakukan dengan menggunakan senyawa ninhidrin. Prinsip dari metode ini adalah ninhidrin yang mula-mula berwarna kuning akan bereaksi dengan asam amino dan berubah warna menjadi biru-ungu. Warna biru-ungu yang terbentuk kepekatannya setara dengan konsentrasi asam amino, artinya semakin besar konsentrasi asam amino, maka semakin banyak ninhidrin yang bereaksi dengan asam amino menjadi senyawa kompleks
Ruhemman yang berwarna ungu, sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Boyer, 2011).
Ninhidrin bereaksi dengan gugus amino alfa yang terdapat dalam semua asam amino, peptida, dan protein. Uji ini merupakan uji yang cepat dan sensitif dalam mendeteksi asam amino, namun uji ini tidak selektif sehingga tidak bisa digunakan dalam menentukan asam amino dalam tingkat individu apabila digunakan dalam larutan yang berisi campuran asam amino. Struktur ninhidrin ditunjukan dalam gambar di bawah ini.
Gambar 1. Struktur ninhidrin (Bettelheim dan Landesberg, 2009)
D. Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron bebas yang tak berpasangan (unpaired electron). Hal ini dapat dilihat misalnya pada air (H2O). Ikatan atom oksigen dengan hidrogen pada air merupakan ikatan
kovalen, yaitu ikatan kimia yang timbul karena sepasang elektron dimiliki bersama oleh dua atom. Elektron yang tidak memiliki pasangan cenderung akan menarik eletron dari senyawa lainnya, sehingga elektron tersebut akan dimiliki bersama oleh dua atom atau senyawa dan terbentuk suatu senyawa radikal bebas baru yang lebih reaktif. Reaktivitas yang meningkat tersebut menyebabkan
senyawa radikal bebas menjadi lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam tubuh. Jika pertahanan tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak (Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi, 2010).
Radikal bebas tersebut memiliki 2 sifat yaitu:
1. Reaktivitasnya yang tinggi karena akan cenderung menarik elektron dari senyawa yang lainnya lagi.
2. Memiliki kemampuan untuk mengubah suatu molekul, atom, atau senyawa untuk menjadi suatu radikal baru (Morello, Shahidi, Ho, 2002).
Target utama radikal bebas adalah protein, karbohidrat, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur-unsur DNA. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker. Radikal bebas akan terus mencari elektron dari molekul-molekul di sekitarnya dan apabila tidak dikendalikan reaksi berantai ini dapat berlangsung secara terus menerus (Halliwell dan Gutteridge, 2000).
E. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat
yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Sunardi, 2007).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan diklasifikasikan menjadi dua kategori, yaitu antioksidan pencegah dan antioksidan pemutus rantai. Antioksidan pencegah bekerja dengan menghambat pembentukan reactive oxygen
species (ROS), seperti enzim katalase, peroksidase, superoksida dismutase, dan
transferin. Antioksidan pemutus rantai merupakan senyawa yang menangkap radikal oksigen kemudian memutus rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya vitamin C, vitamin E, asam urat, bilirubin, polifenol, dan sebagainya. Antioksidan pemutus rantai memiliki dua jaul reaksi. Jalur pertama merupakan jalur transfer atom hidrogen dengan mekanisme radikal oksigen menangkap hidrogen dari antioksidan sehingga terbentuk kompleks antioksidan radikal yang bersifat stabil. Jalur kedua, antioksidan mendeaktivasi radikal bebas dengan transfer elektron tunggal. Transfer elektron tunggal sangat dipengaruhi oleh kestablilan pelarut pada muatan tertentu (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).
F. Metode DPPH
Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical
scavengers atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidannya, serta
DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).
Gugus kromofor dan auksokrom pada radikal bebas DPPH memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga menimbulkan warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning seiring penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap. Mekanisme penangkapan radikal ditunjukan pada reaksi di bawah ini.
Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (AH=Antioksidan, ox=Oksidasi, red=Reduksi) (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009)
G. Landasan Teori
Reaksi oksidasi berlebihan yang terjadi di dalam tubuh dapat memicu terbentuknya radikal bebas. Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan, sehingga tidak stabil. Untuk mencapai kestabilan, elektron tidak berpasangan akan mencari pasangan elektron di sekitarnya. Radikal bebas dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid, DNA,
dan dapat memicu penyakit degeneratif (Uppu, Murthy, Pryor, dan Parinandi, 2010). Senyawa antioksidan dapat meredam radikal bebas dan menghambat reaksi oksidatif, sehingga kerusakan sel akibat radikal bebas dapat dicegah (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).
Nanas merupakan tanaman yang mudah ditemukan di daerah tropis. Kandungan buah nanas yang sudah banyak diteliti dan dipublikasikan salah satunya adalah bromelain (Bartholomew, Paull, dan Rohrbach, 2002). Bromelain merupakan salah satu enzim protease yang umum digunakan dalam perawatan luka. Enzim protease yang digunakan dalam perawatan luka untuk regenerasi jaringan dan mencegah timbulnya keloid berpotensi memiliki aktivitas antioksidan (Bhattacharyya, 2008).
Kandungan enzim dalam suatu sampel dapat dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan metode uji ninhidrin dan kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometri uv. Prinsip uji ninhidrin yaitu pembentukan warna biru- ungu dari reaksi antara ninhidrin dan asam amino (Boyer, 2011). Prinsip spektrofotometri yaitu protein yang memiliki cincin aromatik seperti fenilalanin, triptofan, histidin, dan tirosin memiliki serapan yang kuat pada panjang gelombang 280 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut sebanding dengan jumlah enzim dalam sampel (Walker, 2002).
Metode DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang sederhana dan cepat. Metode ini menggunakan radikal bebas DPPH untuk menguji suatu senyawa antioksidan dalam meredam radikal bebas. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang
gelombang 517 nm dengan warna ungu. Warna ungu akan berubah menjadi kuning ketika terdapat senyawa antioksidan yang meredam radikal bebas DPPH (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).
H. Hipotesis
1. Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50.
2. Ekstrak bromelain daging buah nanas (Ananas comosus (L.) Merr.) memiliki kadar enzim yang dinyatakan dengan persen (% b/b).
18
