3. METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.5 Isolasi senyawa target dengan metode spesifik
Isolasi senyawa target dengan metode spesifik dimaksudkan untuk memperoleh senyawa yang terdapat pada ekstrak aktif inhibitor topoisomerase I. Metode spesifik yang dimaksud adalah ekstraksi alkaloid dan steroid.
Ekstraksi alkaloid
Metode yang digunakan merujuk pada Harborne (1987). Metode tersebut dipilih diantara metode lain karena pertimbangan jumlah ekstrak yang dihasilkan dan tetap mengikuti pada ketentuan pemilihan pelarut untuk memperoleh senyawa target. Bagan alir ekstraksi alkaloid disajikan pada Gambar 11.
Gambar 11 Bagan alir ekstraksi alkaloid (Harborne 1987).
Ekstraksi steroid
Ekstraksi setroid mengacu pada Bahti et al. (1983) yang dikutip oleh Heryani (2002). Penghilangan lemak dilakukan dengan cara partisi dengan
Ekstrak
Direndam dengan metanol air (4:1) (24 jam)
Filtrat diuapkan
(sampai 1/10 volume awal, suhu 40 oC)
Diasamkan (pH 3-4) dengan H2SO4 2M
Diekstraksi dengan kloroform (3x)
diuapkan
Dibasakan sampai pH 10 (+NH4OH)
Diekstraksi dengan CHCl 3-MeOH
(3:1) (2x) Diuapkan lapisan CHCl3-MeOH Diekstraksi dengan MeOH Ekstrak Polar Pertengahan (EPP)
Lapisan kloroform Lapisan air
Ekstrak Basa (EB) Ekstrak Polar (EP) Lapisan air basa
34
pelarut heksana. Diagram proses ekstraksi steroid secara skematis disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Bagan alir ekstraksi steroid (Bahti et al. 1983 diacu dalam Heryani 2002).
Ekstrak
Dihidrolisis dengan KOH 10% (dalam etanol) (di atas penangas air 100 oC, 3 jam)
Disaring
Rotavapor Filtrat
Diekstraksi dengan dietil eter Hidrolisat kering
Ekstrak dietil eter Ampas (dibuang)
Dicuci berturut-turut dengan (H2O, HCl 2N, H2O, NaHCO3 jenuh,
NaCl jenuh)
Fase dietil eter
Fase air (pencuci) dibuang
Dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat
Ekstrak dietil eter
4.1 Kandungan Gizi Kablang 4.1.1 Analisis proksimat
Nilai gizi dari suatu produk merupakan parameter yang sangat penting karena merupakan salah satu pertimbangan konsumen dalam menentukan pilihan terhadap makanan. Salah satu cara untuk menentukan kandungan gizi suatu produk adalah analisis proksimat.
Analisis proksimat terhadap daging Kablang (Nerita albicilla) meliputi pengukuran kadar air, protein, lemak, abu, serat kasar dan karbohidrat (by difference). Hasil analisis proksimat daging Nerita albicilla disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Hasil analisis proksimat daging kering Kablang dibandingkan dengan produk perikanan lainnya
Komposisi Kablang (Nerita
albicilla) Bekicot (Achatina fulita)** Kerang darah (Anadara granosa)** Teripang batu (Holothuria. scabra)** Air (%) Protein (%) Lemak (%) Abu (%) Serat kasar (%) Karbohidrat * (%) 12,44 62,05 5,58 9,17 6,60 4,16 5,69 72,47 4,55 11,25 - 11,72 6,32 79,92 6,78 5,64 - 1,34 10,34 54,05 6,30 28,02 - 1,29 * by difference ** Sumber : Witjaksono (2005).
Tabel 1 memperlihatkan bahwa Kablang memiliki kadar air sebesar 12,44%, kadar protein 62,05%, kadar lemak 5,58%, kadar abu 9,17%, serat kasar 6,60% dan karbohidrat 4,16%. Walaupun dibandingkan dengan kandungan protein komoditas invertebrata perikanan lainnya yaitu bekicot (72,47%) dan kerang darah (79,92%) terlihat lebih rendah dan sedikit lebih tinggi dari kandungan protein teripang batu akan tetapi kandungan protein Kablang dapat meningkat lagi disebabkan kadar airnya yang masih cukup tinggi.
Protein adalah sumber asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein juga mengandung fosfor, belerang, dan unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno 1997). Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di
36
dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme (Lehninger 1997).
Fungsi utama protein bagi tubuh yaitu membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang sudah ada. Secara garis besar fungsi protein yaitu sebagai enzim, alat pengangkut dan penyimpan, pengatur pergerakan, penunjang mekanis, pembangun sel-sel jaringan tubuh, pertahanan tubuh, bahan bakar dan pemberi tenaga, menjaga asam basa cairan tubuh, membuat protein darah, dan media perambatan impuls saraf (Nasoetion et al. 1994).
Kekurangan protein menyebabkan malnutrisi protein pada anak saat lahir (kwashiorkor), defisiensi energi bersama protein (marasmus), atau gabungan keduanya yang dapat mengakibatkan kegagalan pertumbuhan ringan sampai suatu sindrom klinis berat yang spesifik. Keadaan tersebut tidak hanya dipengaruhi oleh intake makanan, tetapi juga oleh keadaan lingkungan seperti pemukiman, sanitasi dan higiene, serta infeksi berulang yang pernah dialami tubuh (Effendi 2002). Kelebihan protein bisa menyebabkan obesitas karena makanan yang tinggi protein biasanya tinggi lemak. Selain itu, kelebihan protein menyebabkan asidosis, dehidrasi, diare, kenaikan amoniak darah, kenaikan urea darah, dan demam. Asam amino yang berlebihan akan memberatkan kerja ginjal dan hati yang harus memetabolisme dan mengeluarkan kelebihan nitrogen (Almatsier 2002).
Lemak di alam mengandung 98% sampai 99% trigliserida, 1-2% monogliserida, digliserida, asam lemak bebas dan fosfolipid. Komponen utama lemak hewan adalah palmitat, stearat dan oleat dengan sejumlah linoleat dan sedikit asam arakidonat (Poejiadi dan Supriyanti 2006). Asam-asam lemak esensial ini berperan dalam transpor lemak , metabolisme dan memelihara fungsi membran sel. Selanjutnya Childs (1987) dalam Harli (2003) menyatakan bahwa daya serap kolesterol paling rendah berasal dari diet kerang dibandingkan dengan diet ayam dan kepiting yaitu 25 persen dibandingkan dengan kolesterol ayam dan kepiting.
Abu merupakan salah satu komponen dalam bahan makanan. Komponen ini terdiri dari kalsium, fosfor, natrium dan tembaga (Winarno 1995). Menurut Apriyantono et al. (1989), kadar abu menunjukkan besarnya jumlah mineral yang terkandung dalam bahan pangan tersebut. Mineral merupakan bagian dari unsur
pembentuk tubuh yang memegang peranan penting dalam pemiliharaan fungsi tubuh. Kekurangan mineral terutama kalsium pada masa pertumbuhan dapat menyebabkan gangguan pertumbuhan, tulang kurang kuat, mudah bengkok, dan rapuh. Semua orang dewasa, terutama sesudah usia lima puluh tahun, kehilangan kalsium dari tulangnya. Tulang menjadi rapuh dan mudah patah, hal ini dinamakan osteoporosis yang dapat dipercepat oleh keadaan stress sehari-hari (Almatsier 2002). Kalsium juga berkaitan sangat erat dengan fosfor dalam tubuh. Metabolisme kedua unsur ini berhubungan dengan sejumlah mekanisme fisiologis tubuh. Kalsium mempunyai peranan penting dalam proses kontraksi otot, menjaga normalitas kerja jantung dan merupakan aktivator enzim-enzim tertentu (Poejiadi dan Supriyanti 2006).
Fosfat penting bagi tubuh terutama fungsinya sebagai bagian dari struktur gigi dan tulang juga terdapat dalam bentuk senyawa ATP dan kreatin fosfat, koenzim dari golongan vitamin B, protein konjugasi dan fosfolipid. Fosfor dalam makanan dapat diserap oleh tubuh sekitar 70%. Penyerapan fosfor dibantu oleh Vitamin D.
Natrium pada tubuh manusia dan hewan didapatkan dalam bentuk ion terdisosiasi dan merupakan partikel-partikel utama yang berperan untuk osmolitas cairan, mempengaruhi kekuatan ionik sehingga mempengaruhi kelarutan dari protein dan komponen lainnya (Linder 2006). Selanjutnya dijelaskan bahwa Natrium (Na) dalam diet terutama dalam bentuk NACl, secara alamiah atau sengaja ditambahkan untuk meningkatkan rasa. Sedangkan mineral tembaga berperan dalam proses maturasi sel-sel darah merah dan proses pembentukan hemoglubin dan mempermudah absorbsi besi.
Karbohidrat pada hewan digolongkan dalam polisakarida yang merupakan senyawa karbohidrat kompleks. Glikogen adalah salah satu polisakarida dan merupakan "pati hewani" yang terdapat pada otot hewan, manusia dan ikan. Glikogen ini larut di dalam air dan bila bereaksi dengan lodium (I) akan menghasilkan warna merah (Poedjiadi dan Supriyanti 2006). Sebagian besar karbohidrat (2/3) yang dimakan akan disimpan didalam otot dan selebihnya disimpan didalam hati sebagai glikogen namun apabila hati (hepar) mengalami gangguan maka tugas ini tidak akan dijalankannya. Oleh karena itu, ketika tubuh
38
memerlukan energi maka yang seharusnya simpanan glikogen lebih dulu dimanfaatkan akan digantikan oleh lemak yang ditimbun didalam jaringan lemak, karena biasanya kelebihan karbohidrat yang tidak dapat disimpan sebagai glikogen akan diubah menjadi lemak dan disimpan di jaringan lemak.
Komponen-komponen bioaktif dalam makanan dapat terbentuk secara alami atau terbentuk selama proses pengolahan makanan. Komponen bioaktif ini meliputi senyawa yang berasal dari karbohidrat, protein, lemak, dan komponen- komponen yang terdapat secara alami di dalam pangan. Banyak komponen bioaktif pangan saat ini diketahui mempunyai efek positif terhadap kesehatan, oleh karena itu penggunaan pangan (Kablang) yang diketahui mengandung senyawa bioaktif atau pangan fungsional merupakan hal yang bermanfaat karena memiliki fungsi fisiologis bagi tubuh. Secara tradisional Kablang digunakan untuk mengobati penyakit hati dan dalam penelitian ini juga dilakukan uji terhadap ekstrak dari kablang yang memiliki aktivitas menghambat kerja dari enzim topoisomerase I yang berperan dalam pengobatan kanker.
Dari uraian di atas maka dapat dijelaskan hubungan antara komponen gizi dari Kablang dengan penyakit kanker adalah erat kaitannya dengan sel-sel imun dari penderita kanker. Kemampuan sel-sel imun sangat tergantung pada zat-zat gizi yang dibawa oleh makanan. Bila zat-zat gizi telah cukup, tambahan makanan akan lebih meningkatkan kemampuan sel-sel imun dalam usahanya melawan berbagai mikroorganisme yang masuk dalam tubuh kita, yaitu virus dan bakteri.
Lebih lanjut lagi, sel natural killer (NK) diuji secara in vitro dengan cara diadu dengan sel-sel kanker darah atau leukemia. Hasilnya menunjukkan kemampuan sel NK membunuh sel kanker dua kali lebih tinggi dibandingkan dengan sel NK dari mereka yang tidak mendapat makanan yang bergizi. Sel NK adalah sel imun yang tugas utamanya adalah membasmi virus yang telah berhasil masuk dalam sel tubuh dan menghancurkan sel yang telah termutasi sehingga bahan atau senyawa yang dapat meningkatkan kemampuan sel imun ini dapat diartikan meningkatkan pencegahan terhadap bakteri, virus dan penyakit kanker.
4.1.2 Komposisi asam amino
Kualitas suatu protein dapat ditentukan dengan mengetahui kandungan asam aminonya. Hasil analisis komposisi asam amino dari Kablang (Nerita albicilla) dengan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) disajikanpada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil analisis komposisi asam amino Kablang (Nerita albicilla) dan kerang serta ikan sebagai pembanding
No.
Asam amino
% dalam 100 gram sampel
Kablang Kerang * Ikan Tuna*
Esensial 1 Histidin 1,89 0,33 0,65 2 Arginin 1,92 1,25 1,32 3 Treonin 2,79 0,74 0,96 4 Valin 2,94 0,75 1,13 5 Metionin 2,41 0,39 0,65 6 Isoleusin 4,71 0,74 1,29 7 Leusin 4,00 1,20 1,79 8 Fenilalanin 2,27 0,61 0,86 9 Lisin 3,34 1,28 2,02 10 Tirosin 2,74 0,55 0,74 11 Sistin 1,22 0,22 0,24 Nonesensial 12 Aspartat 5,19 1,65 2,25 13 Glutamat 8,89 2,33 3,28 14 Serin 1,07 0,77 0,90 15 Glisin 2,32 1,07 1,06 16 Alanin 2,25 1,03 1,33 17 Prolin 1,67 0,70 0,78 * Sumber : http://www.asiamaya.com
Tabel 2 memperlihatkan bahwa kadar tertinggi asam amino Kablang adalah asam glutamat, yaitu 8,89%. Jika dibandingkan dengan asam amino kerang dan ikan tuna yang merupakan salah satu ikan pelagis yang mempunyai nilai ekonomis penting, jenis asam amino yang dihasilkan ketiganya sama tetapi kadar asam amino Kablang lebih tinggi dari kadar asam amino kerang dan ikan tuna. Disamping itu jenis asam amino tertinggi ketiganya sama yaitu asam glutamat, sedangkan asam amino terendah pada Kablang yaitu serin dan pada kerang serta ikan tuna adalah sistin.
40
Nilai sebenarnya dari suatu protein makanan diukur berdasarkan kandungan relatif dari asam-asam amino esensialnya. Mutu protein dinilai dari perbandingan asam-asam amino yang terkandung dalam protein tersebut. Pada prinsipnya suatu protein yang dapat menyediakan asam amino esensial dalam suatu komposisi yang hampir menyamai kebutuhan manusia, mempunyai mutu yang tinggi. Dari 17 asam amino yang terkandung pada Kablang, terdapat 11 asam amino esensial meliputi : histidin, arginin, treonin, valin, metionin, isoleusin, leusin, fenilalanin tirosin, sistin dan lisin serta 6 asam amino non esensial yang meliputi asam aspartat, asam glutamat, serin, glisin, alanin dan prolin (Gambar 13). Triptofan tidak terdeteksi sebab terjadi kerusakan yang disebabkan penambahan HCl 6N dan sedikit kerusakan terjadi pada serin dan treonin (Nur dan Adijuwana 1989). Alkalin atau hidrolisis enzimatis dengan menggunakan NaOH lebih baik digunakan untuk mendeteksi triptofan (White dan Hart 1992). 5,2 8,9 1,1 2,3 1,9 2,8 2,2 1,7 2,9 2,4 1,2 4,7 4,0 2,7 2,3 3,3 1,9 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Aspa rtat Glut ama t Serin Glisi n Hist idin Argi nin Treon in Alan in Pro lin Valin Met ionin Sistin Isol eusi n Leusi n Tiro sin Feni lalani n Lisin Asam amino K ad a r asa m am in o ( % )
Gambar 13 Kandungan asam amino Kablang (Nerita albicilla)
Tabel 3 menunjukkan pengelompokkan asam amino esensial dan nonesensial dari Kablang (Nerita albicilla). Total asam amino esensial (TAAE) Kablang adalah 30,24 mg/g (58,6%), total asam amino esensial tanpa hisitidin dan arginin (TAAETHA) 26,42 mg/g (51,2%), total asam amino semiesensial (TAASE) 3,82 mg/g (7,4%), dan total asam amino nonesensial (TAANE) adalah 21,38 mg/g (49,1%). Kandungan asam amino esensial yang tinggi dan lengkap menunjukkan kualitas dari protein Kablang karena mengandung semua asam amino esensial yang diperlukan oleh tubuh, tetapi masih perlu dilakukan
penentuan skor kimianya untuk mengetahui daya serap asam amino esensial tersebut oleh tubuh. Komposisi asam amino menunjukkan bahwa total asam amino netral, asam dan basa berturut-turut adalah 58,9%, 27,3% dan 13,9%.
Tabel 3 Analisis asam amino esensial dan non esensial dari Nerita albicilla (mg/g protein)
* TAAETHA: Total asam amino esensial tanpa histidin dan arginin
Perbandingan antara asam amino esensial Kablang dengan pola kebutuhan asam amino yang direkomendasikan oleh FAO/WHO (1991) disajikan pada Tabel 4. Dari Tabel 4 tersebut dapat dilihat bahwa angka terendah ditunjukkan oleh asam amino leusin, yaitu 92,2, sedangkan kedua terendah ditunjukkan oleh asam amino valin, yaitu 94,7. Ini berarti bahwa skor kimia protein Kablang adalah 92,2, dengan asam amino pembatas yang utama adalah leusin dan asam amino pembatas kedua adalah valin. Dari data tersebut dapat diartikan bahwa sekitar 92,2 persen dari total asam amino esensial yang terkandung dalam protein Kablang dapat digunakan oleh tubuh untuk sintesis protein tubuh, sedangkan asam amino esensial yang harus ditambahkan (suplementasi) untuk meningkatkan nilai gizi protein Kablang adalah leusin,valin dan lisin.
Tabel 4 Skor kimia asam amino Kablang
Asam amino esensial Kadar dalam sampel (mg/g prot.)
Referensi FAO (1991) (mg/g prot)
Skor kimia asam amino esensial Isoleusin Leusin Lisin Metionin + sistin Fenilalanin + tirosin Treonin Valin 75,9 64,5 53,8 58,6 80,7 44,9 47,3 40 70 55 35 60 40 50 100 92,2 97,8 100 100 100 94,7
Ket: Triptofan bukan asam amino pembatas karena tidak dilakukan analisis
Asam amino Nerita albicilla %
Total asam amino
Total asam amino esensial (TAAE) Total asam amino esensial (TAAETHA)* Total asam amino semiesensial (TAASE) Total asam amino nonesensial (TAANE) Total asam amino netral (TAAN) Total asam amino asam (TAAA) Total asam amino basa (TAAB)
51,6 30,2 26,4 3,9 21,4 30,4 14,1 7,2 - 58,6 51,2 7,4 41,4 58,9 27,3 13,9
42
Hampir semua asam amino mempunyai fungsi khusus. Beberapa asam amino seperti glisin, glutamin, dan arginin dikombinasikan dengan zat lain merupakan komponen penting bagi kesehatan hati karena membantu menetralkan racun yang ada pada hati. Orang yang menderita kelainan pada fungsi hati, artritis yang kronis memiliki persediaan asam amino dalam tubuh yang cukup rendah. Asam amino berantai panjang valin, isoleusin, dan leusin, yang berperan membantu detoksifikasi dan meningkatkan fungsi hati (Anonim 2003). Kandungan valin (2,94%), isoleusin (4,71%) dan leusin (4,00%) yang cukup tinggi diduga berperan dalam penyembuhan penyakit hati, sesuai dengan pengalaman empiris masyarakat Desa Sather yang memanfaatkan Kablang untuk mengobati penyakit hati.
4.2 Ekstraksi Bahan Aktif
Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu bahan. Maserasi merupakan salah satu prosedur ekstraksi yang sering digunakan (Harborne 1987), dimana penelitian ini menggunakan maserasi untuk proses ekstraksi. Setelah dilakukan proses ekstraksi dari Nerita albicilla dihasilkan tiga ekstrak yang berbeda berdasarkan perbedaan jenis pelarut yang digunakan yaitu ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Rendemen merupakan perbandingan antara berat ekstrak yang dihasilkan dengan berat awal bahan yang digunakan dan dinyatakan dalam persen (%). Hasil ekstraksi Nerita albicilla dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Rendemen hasil ekstraksi Nerita albicilla
Ekstrak Berat awal
sampel (g) Volume pelarut (ml) Berat rendemen (g) % rendemen (b/b) Heksana 50,060 100 1,025 2,05 Etil asetat 50,060 100 0,780 1,56 Metanol 50,060 100 3,495 6,99
Tabel 5 menunjukkan rendemen ekstrak yang tertinggi dihasilkan dari ekstraksi dengan pelarut metanol (6,99%) diikuti berturut-turut oleh ekstrak heksana (2,05%) dan ekstrak dengan pelarut etil asetat (1,56%). Pelarut metanol menghasilkan rendemen ektrak tertinggi karena kemampuan pelarut metanol yang
dapat melarutkan seluruh kandungan kimia dari sampel sampai ke dalam ruang antar sel, sehingga komponen kimia yang ada pada sampel dapat tersari secara sempurna.
4.3 Aktivitas Inhibitor Topoisomerase I
Uji aktivitas inhibitor topoisomerase dari ekstrak Kablang menggunakan Topoisomerase I Drug Screening Kit dari TopoGen dengan menggunakan kontrol positif Camptothecin. Camptothecin secara luas telah digunakan sebagai model dalam pencarian senyawa antikanker dari bahan alam. Camptothecin dan turunannya bekerja dengan mengikat dan mestabilkan kompleks kovalen DNA topoisomerase sehingga menghambat kerja topoisomerase I (Dewick 2001).
Aktivitas inhibisi terhadap kerja dari enzim DNA topoisomerase sebagai target obat antikanker terjadi melalui dua mekanisme penghambatan yaitu katalitik (catalytic inhibitor) dan poison (cleavable complex). Aktivitas penghambatan ekstrak Kablang ditandai dengan adanya perubahan bentuk dari DNA superkoil dari substrat menjadi nick complex DNA bila ekstrak bersifat poison atau tetap berbentuk superkoil bila bersifat katalitik inhibitor. Pita dari DNA relaks hasil reaksi substrat dengan topoisomerase I dapat dicocokkan dengan pita DNA relaks marker. Hasil pengujian inhibitor topoisomerase I dari ekstrak heksana, etil asetat dan metanol disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6 Hasil elektroforesis uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I dari ekstrak Kablang
Nama Ekstrak Aktivitas inhibisi pada konsentrasi 50 µg/ml Ekstrak heksana + (katalitik) Ekstrak etil asetat + (poison) Ekstrak metanol + (poison)
+: menghambat enzim topoisomerase I
Ekstrak heksana, etil asetat dan metanol yang diuji pada konsentrasi 50 µg/ml dapat menghambat aktivitas enzim topoisomerase I dengan kontrol positif camptothecin pada konsentrasi 100 µM (34,84 µg/ml). Aktivitas inhibitor topoisomerase I dari ekstrak heksana menunjukkan mekanisme penghambatan yang bersifat katalitik, sedangkan ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol bersifat poison (Gambar 14).
44
Gambar 14 Hasil elektroforesis uji inhibisi ekstrak terhadap enzim DNA topoisomerase I pada konsentrasi 50 µg/ml.
4.4 MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Topoisomerase I dari Ekstrak Metanol
Untuk mengetahui aktivitas inhibitor topoisomerase pada konsentrasi yang lebih rendah, maka ditentukan nilai MIC (minimum inhibitory concentration) yaitu konsentrasi terkecil dari ekstrak yang masih memiliki hambatan terhadap aktivitas enzim topoisomerase I. Ekstrak metanol dipilih karena menghasilkan rendemen tertinggi. Hasil uji inhibisi ekstrak metanol terhadap enzim topoisomerase I menunjukkan nilai MIC pada konsentrasi 2,5 µg/ml dengan kontrol positif camptothecin pada konsentrasi 100 µM (34,84 µg/ml) (Tabel 7 dan Gambar 15), yang terlihat dengan masih adanya substrat pada gel DNA seperti pada kontrol no 5.
Tabel 7 Hasil uji inhibisi ekstrak metanol terhadap enzim topoisomerase I pada berbagai konsentrasi
Konsentrasi
(µg/ml) Inhibisi Topo 1 Keterangan 100 50 25 12,5 5 2,5 1,25 + + + + + + -
Menghambat topo 1, bersifat poison Menghambat topo 1, bersifat poison Menghambat topo 1, bersifat poison Menghambat topo 1, bersifat poison Menghambat topo 1, bersifat poison Menghambat topo 1, bersifat poison Tidak menghambat topo 1
1 2 3 4 5 6 7 8
Keterangan : 1. Relaks DNA hasil reaksi (Topo I + DNA), 2. Marker DNA superkoil, 3. Relaks DNA hasil reaksi (Topo I + DNA + DMSO), 4. Marker DNA relaks, 5. Topo I + DNA + camptothecin, 6. Ekstrak heksana, 7. Ekstrak etil asetat, 8. Ekstrak metanol
Keterangan : 1. Relaks DNA hasil reaksi (Topo I + DNA), 2. Marker DNA Superkoil, 3. Relaks DNA hasil reaksi (Topo I + DNA + DMSO), 4. Marker DNA relaks, 5. Topo I + DNA + camptothecin, 6. Ekstak metanol 100 µg/ml, 7. Ekstak metanol 50 µg/ml, 8. 25 µg/ml, 9. 12,5 µg/ml, 10. µg/ml, 11. 2,5 µg/ml, 12. 1,25 µg/ml.
Gambar 15 Hasil elektroforesis uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I dari ekstrak metanol Nerita albicilla pada berbagai konsentrasi.
Pada konsentrasi 1,25 µg/ml (sumur no.12) menunjukkan ekstrak metanol Kablang tidak lagi mampu melakukan penghambatan pada kerja enzim topo I terlihat dengan terbentuknya relaks DNA seperti pada kontrol no 4 (marker DNA relaks). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol Nerita albicilla berpotensi sebagai inhibitor topoisomerase I, seperti yang dinyatakan oleh Zahir (1996) bahwa suatu senyawa bahan alam dikatakan aktif sebagai inhibitor enzim topoisomerase bila nilai MIC kurang dari 10 µg/ml.
Ekstrak metanol menunjukkan aktivitas hambatan terhadap enzim DNA topoisomerase I pada konsentrasi 2,5 µg/ml, sehingga ekstrak metanol berpotensi sebagai antikanker. Sukardiman et al. (2002) menyatakan bahwa senyawa yang memiliki hambatan terhadap aktivitas enzim DNA topoisomerase sebagian besar terkait dengan mekanisme kematian sel kanker dengan cara menginduksi apoptosis, dimana sel kanker akan mati dengan memakan sesama sel kanker. Pada aplikasi kliniknya nanti diharapkan akan lebih selektif, dimana ekstrak hanya membunuh sel kankernya saja tanpa membunuh sel normal. Dengan demikian efek samping dari obat-obatan antikanker yang merugikan dapat dihindari, apabila digunakan obat yang memiliki mekanisme sitotoksik dengan cara menginduksi apoptosis.
4.5 Karakterisasi Ekstrak Aktif Inhibitor Topoisomerase I
Uji ini dilakukan untuk mengetahui kelompok senyawa yang terdapat pada ekstrak aktif inhbitor topoisomerase I. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 8.
6 6
46
Tabel 8 Hasil uji kimiawi ekstrak aktif Inhibitor topoisomerase I Kablang (Nerita albicilla)
Keterangan : + positif ; - negatif
Uji Molisch positif menunjukkan bahwa dalam ekstrak mengandung karbohidrat yang ditandai dengan terbentuknya lapisan ungu saat pengujian. Karbohidrat dalam ekstrak dipecah oleh asam sulfat pekat menjadi gugus furfural yang akan bereaksi dengan sulfonat alfanaftol membentuk senyawa berwarna ungu. Hasil uji menunjukkan adanya karbohidrat pada ekstrak etil asetat, sedangkan ekstrak heksana dan metanol menunjukkan uji molisch yang negatif.
Uji Bradford positif menunjukkan bahwa dalam ekstrak mengandung protein yang ditandai dengan terbentuk warna biru. Uji Bradford menggunakan pereaksi coomassie blue yang terdapat dalam reagen Bradford. Coomassie blue tersebut mengikat protein membentuk kompleks berwarna biru. Hasil uji menunjukkan adanya protein pada semua ekstrak. Ekstrak metanol memiliki warna biru yang paling pekat (secara visual) dibandingkan dengan warna biru yang dihasilkan ekstrak lainnya.
Uji Pereaksi Hasil Ekstrak : Heksana Etil. asetat Metanol Molish (Karbohidrat)
Pereaksi Molish + H2SO4 pekat
+ terbentuk warna ungu - + -
Bradford (Protein)
Pereaksi Bradford
+ terbentuk warna biru/ungu + + ++
Ninhidrin (Asam amino)
Ninhidrin
+ terbentuk warna ungu + - ++
Alkaloid Dragendorff
+ terbentuk endapan merah jingga Mayer
+ terbentuk endapan putih Wagner
+ terbentuk endapan coklat
- - - - - - + + + Saponin Pengocokan
+ dalam 10 menit setelah pengocokan buih tidak hilang
- - -
Flavonoid H2SO4 10%
+ terbentuk warna merah - - -
Fenol hidrokuinon NaOH 10%
+ terbentuk warna merah - - -
Triterpenoid Lieberman Burchard
+ terjadi perubahan warna merah atau ungu
- - -
Steroid Lieberman Burchard
+ terjadi perubahan warna menjadi hijau
Uji ninhidrin positif menunjukkan bahwa dalam ekstrak mengandung asam amino bebas yang ditandai dengan terbentuknya warna biru atau ungu muda. Warna tersebut merupakan warna khas pada asam amino. Akan tetapi prolin dan hidroksiprolin yang mempunyai gugus amina sekunder menghasilkan warna kuning jika bereaksi dengan ninhidrin, sedangkan asparagin yang mengandung gugus amida bebas bereaksi membentuk warna coklat. Gugus amina dapat bereaksi dengan pereaksi ninhidrin membentuk amonia, CO2 dan aldehida (Girinda 1993). Uji ninhidrin yang dilakukan menunjukkan warna ungu muda pada ekstrak heksana dan metanol, sedangkan ekstrak etil asetat menunjukkan ninhidrin negatif.