Satu hal penting yang dibutuhkan untuk mendeteksi suatu mikroba dengan menggunakan real- time PCR adalah DNA mikroba tersebut yang murni tanpa pengotor. Cara memperolehnya adalah dengan mengisolasi/mengekstraksi DNA dari dalam sel. Berbagai teknik ekstraksi DNA salah satunya metode pendidihan telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA dalam bentuk kit, dimana prosesnya cukup mudah, cepat, dan sederhana (Sulandari dan Zein 2003).
1.
Isolasi/Ekstraksi DNA dengan Metode Pendidihan
DNA yang berasal dari bakteri Gram negatif (contohnya: Salmonella) dapat dengan mudah diisolasi/diekstraksi dengan menggunakan metode pendidihan atau mendidihkan sel bakteri di dalam air (Lee et al. 2006). Kemurnian isolat DNA yang dihasilkan dapat diketahui dengan mengukurnya pada UV-VIS spektrofotometer. Isolat DNA dikatakan murni jika rasio diantara nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 berada pada selang 1,8 hingga 2,0 (Nolan
et al. 2007). Di bawah ini merupakan hasil pengukuran kemurnian isolat/template DNA yang diperoleh dengan metode pendidihan (Tabel 2.).
Tabel 2. Kemurnian isolat DNA Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei dengan metode pendidihan
Sampel A1 (260) A2 (280) Rasio A1/A2 [DNA] ng/µl [Protein] ng/µl Spike ST1 0,068 0,097 0,6 0,367 86,964 Spike ST2 0,068 0,096 0,6 0,356 82,964 Spike SS1 0,071 0,100 0,6 0,360 85,708 Spike SS2 0,062 0,089 0,6 0,329 81,386 KM ST1 0,127 0,077 1,6 5,188 23,002 KM ST2 0,098 0,059 1,7 4,009 16,948 KM SS1 0,079 0,057 1,4 2,909 28,399 KM SS2 0,105 0,076 1,4 3,871 36,948
Ket: Spike ST1 & 2 (Sampel susu UHT spikeSalmonella Typhimurium ulangan 1 dan 2); Spike SS1 & 2 (Sampel susu UHT spikeShigella sonnei ulangan 1 dan 2); KM ST1 & 2 (Kultur Murni Salmonella
Typhimurium ulangan 1 dan 2); KM SS1 & 2 (Kultur Murni Shigella sonnei ulangan 1 dan 2). A1 adalah nilai absorbansi pada panjang gelombang 260; A2 adalah nilai absorbansi pada panjang gelombang 280.
Berdasarkan hasil pengukuran spektrofotometri tersebut menunjukkan bahwa isolat DNA yang dihasilkan dari metode pendidihan belum murni yang artinya selain DNA, masih terdapat pengotor yang terkandung di dalam isolat tersebut salah satunya adalah protein. Hal ini ditunjukkan dengan nilai rasio yang tidak berada pada selang 1,8-2,0 baik pada sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei maupun sampel kultur murni Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei yang diambil dari media pengayaan HIB. Adanya pengotor pada isolat tersebut ditunjukkan pula dengan tingginya nilai konsentrasi protein yang dihasilkan.
Nilai konsentrasi protein yang dihasilkan pada sampel susu UHT spike jauh lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi protein yang diperoleh dari sampel kultur murni mikroba spesifik. Hal tersebut menunjukkan bahwa perlu adanya modifikasi metode pendidihan khusus untuk sampel pangan yang mengandung protein tinggi seperti susu. Selain mengandung protein, susu juga mengandung lemak, kation (kalsium/Ca2+), dan pengkelat yang tinggi dimana komponen pangan tersebut menjadi inhibitor pada pengujian dengan menggunakan real-time PCR. Inhibitor tersebut dapat mengikat dan menurunkan aktivitas enzim polimerase, menyebabkan perubahan konformasi dalam DNA target, atau bersaing dengan primer untuk menempati primer binding sites (Lee et al. 2006 dan Siebert 1999).
Hasil spektrofotometri tersebut membuktikan bahwa tahap pengisolasian DNA dari suatu matriks pangan merupakan hal yang sangat kritis dan kompleks dalam menjalankan pengujian dengan menggunakan real-time PCR. Keberadaan komponen gizi pada pangan dapat menjadi inhibitor PCR dimana dapat memberikan efek yang bervariasi, tetapi secara umum inhibitor tersebut dapat mempersulit pendeteksian DNA bakteri yang memiliki konsentrasi rendah (Lee et al. 2006).
Hasil isolasi/ekstraksi DNA pada penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Amagliani et al. (2006) yang membandingkan metode isolasi/ekstraksi DNA dengan cara pendidihan dan dengan kit komersial DNeasy Tissue Kit (Qiagen) berdasarkan pengukuran rasio
A260/A280 pada UV-1700 spektrofotometer di dalam sampel pangan keju mozarela yang kaya akan lemak dan kalsium sebagai inhibitor dimana inhibitor tersebut juga terkandung pada susu UHT sebagai sampel pangan yang diuji pada penelitian ini. Penelitian Amagliani et al. (2006) tersebut menunjukkan bahwa metode pendidihan menghasilkan kemurnian isolat DNA yang kurang baik dimana nilai rasio A260/A280 lebih rendah dari 1,8.
Hal tersebut terbukti pada pengujian kuantifikasi Salmonella Typhimurium dengan real-time PCR yang akan dibahas pada sub bab selanjutnya. Walaupun terdapat inhibitor di dalam isolat DNA yang diisolasi/diekstraksi dengan metode pendidihan, tetapi isolat tersebut masih dapat teramplifikasi contohnya pada pengujian penentuan spesifisitas primer InvA yang digunakan dan juga pada pengujian penentuan konsentrasi primer yang tepat dimana akan dibahas pada sub bab selanjutnya.
2.
Isolasi/Ekstraksi DNA dengan Kit Komersial
Keberadaan inhibitor baik dalam media kultur murni maupun dalam sampel pangan dapat menghambat proses amplifikasi dengan real-time PCR. Untuk mengatasinya, Chen et al. (1997) diacu dalam Lee et al. (2006) menggunakan metode kit komersial dalam proses isolasi/ekstraksi DNA Salmonella dari sampel susu nonpasteurisasi (raw milk), selain itu juga menggunakan proses pengayaan dan sentrifugasi untuk tahapan memanen/mengambil patogen. Begitu juga Omiccioli et al. (2009) dimana melakukan hal yang sama, namun menggunakan merk kit komersial yang berbeda. Isolat/template DNA yang dihasilkan diuji tingkat kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dimana prinsipnya sama dengan pengukuran isolat DNA metode pendidihan. Hasil pengujiannya dapat dilihat pada Tabel 3. di bawah ini.
Tabel 3. Kemurnian isolat DNA Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei dengan metode kit komersial
Sampel A1 (260) A2 (280) Rasio A1/A2 [DNA] ng/µl [Protein] ng/µl KM ST 0,047 0,029 2,0 1,610 -0,034 KM SS 0,003 0,001 2,0 0,180 0,075 Spike ST 0,036 0,021 2,1 1,305 -0,162
Ket: KM ST (Kultur Murni Salmonella Typhimurium); KM SS (Kultur Murni Shigella sonnei); Spike
ST ( Sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium)
Hasil pengukuran tersebut menunjukkan bahwa isolat DNA ketiga sampel yaitu kultur murni Salmonella Typhimurium, kultur murni Shigella sonnei, dan sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium memiliki nilai rasio yang diharapkan yaitu berada pada selang 1,8-2,0. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemurnian ketiga isolat DNA sangat baik, namun pada sampel susu UHT spike Salmonella Typhimurium, nilai rasio yang dihasilkan sedikit melebihi 2,0. Jika nilai rasio yang dihasilkan melebihi 2,0 maka, hal tersebut mengindikasikan bahwa isolat DNA tidak mengandung/terkontaminasi protein tetapi masih mengandung RNA di dalamnya (Anonoim 2007). Sedangkan kultur murni Salmonella Typhimurium dan kultur murni Shigella sonnei menghasilkan nilai rasio tepat 2,0 dan konsentrasi protein yang dihasilkan pun sangat rendah jika dibandingkan dengan isolat kultur murni Shigella sonnei yang diisolasi/diekstraksi dengan metode pendidihan. Hal ini menunjukkan bahwa metode isolasi dengan menggunakan kit komersial menghasilkan isolat DNA yang jauh lebih murni dibandingkan dengan metode
pendidihan yang dilakukan. Hal tersebut dikarenakan metode kit komersial memiliki prinsip metode dengan perlakuan proteinase K yang diikuti dengan pengikatan DNA pada membran gel silika/filter sehingga kontaminan akan turun/terpisah ke dalam spin column/collection tube (Dauphin et al. 2009).
Hasil isolasi/ekstraksi DNA pada penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Amagliani et al. (2006) yang membandingkan metode isolasi/ekstraksi DNA dengan cara pendidihan dan dengan kit komersial DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Penelitian Amagliani et al. (2006) tersebut menunjukkan bahwa nilai rasio pada isolat DNA yang dihasilkan dengan DNeasy Tissue Kit (Qiagen) dimana memiliki tingkat kemurnian yang kurang baik bahkan lebih jelek dibanding dengan metode pendidihan, namun tidak pada penelitian yang dilakukan dimana isolat/template DNA yang dihasilkan dengan kit komersial QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) menghasilkan isolat/template DNA yang lebih murni dibanding dengan metode pendidihan. Hal tersebut dapat dikarenakan pengaruh modifikasi metode kit komersial yang dilakukan pada penelitian ini dari metode sesungguhnya yang berdasarkan petunjuk produser kit terkait.
Penelitian Amagliani et al. (2006) juga menunjukkan konsentrasi/yield DNA yang dihasilkan dengan metode pendidihan lebih besar dibandingkan dengan metode kit komersial. Hal tersebut juga sesuai dengan penelitian ini dimana konsentrasi DNA kultur murni Salmonella Typhimurium dan kultur murni Shigella sonnei yang diperoleh dengan metode pendidihan lebih besar dibandingkan dengan metode kit komersial, namun tidak terjadi pada sampel susu UHT spike dimana konsentrasi/yield DNA yang dihasilkan lebih besar dengan metode kit komersial dibandingkan dengan metode pendidihan. Hal tersebut dapat menunjukkan bahwa DNA Salmonella Typhimurium lebih mudah diisolasi/diekstraksi dari sampel susu UHT dengan menggunakan metode kit komersial yang dimodifikasi.
Hal yang sama juga ditunjukkan pada penelitian Dauphin et al. (2009) dimana membandingkan kemurnian isolat/template DNA yang dihasilkan dengan berbagai macam kit salah satunya adalah QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) dimana kit tersebut juga digunakan pada penelitian ini. Penelitian yang dilakukan oleh Dauphin et al. (2009) menunjukkan bahwa isolat/template DNA yang dihasilkan dengan kit QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen) memiliki kemurnian yang kurang baik dimana nilai rasio A260/A280 lebih kecil dari 1,8 sehingga menandakan bahwa isolat DNA tersebut masih mengandung inhibitor/pengotor. Hal tersebut tidak sesuai dengan kemurnian yang dihasilkan dari penelitian ini dimana menghasilkan isolat/template DNA dengan kemurnian yang baik. Hal tersebut menunjukkan bahwa modifikasi dengan penambahan CTAB terhadap metode yang berasal dari produsen berkait memperbaiki hasil kemurnian isolat DNA menjadi lebih baik.
