Penelitian dengan judul pemanfaatan asam lemak sawit distilat sebagai bahan baku dietanolamida menggunakan Rhizmomucor meihei dengan metode Response Surface Methodology dijadwalkan seperti Tabel 5
Tabel 5. Jadwal Penelitian Bulan (2007-2008) No. Urut Kegiatan Penelitian 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 Penelusuran Kepustakaan 2 Persiapan Alat dan Bahan 3 Penelitian Pendahuluan 4 Penulisan Proposal 5 Penelitian Utama & Kinetika 6 Analisa Produk 7 Pengolahan Data& Lap.hasil
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian Pendahuluan 4.1.1 Screening Biokatalis
Percobaan pendahuluan diawali dengan melakukan screening biokatalis yang akan digunakan dalam penelitian selanjutnya. Biokatalis yang digunakan adalah enzim lipase yang mampu bekerja pada substrat asam lemak dan minyak. Rhizomucor meihei dan Candida antartica adalah dua jenis lipase yang dijustifikasi mampu bekerja pada substrat asam lemak sawit distilat yang banyak mengandung asam palmitat. Kedua jenis enzim lipase ini dapat digunakan dalam reaksi esterifikasi lemak (Hasan dkk, 2005).
Percobaan screening enzim ini dilakukan pada temperatur ruang (30oC), konsentrasi biokatalis 10% (b/b) dengan rasio mol 1:1 antara asam asam lemak sawit distilat (ALSD) terhadap dietanolamina. Reaksi amidasi berlangsung selama 24 jam dan sampling dilakukan dengan interval waktu 4 jam untuk analisa bilangan asam. Sebagai kontrol reaksi terhadap reaksi amidasi ini, dilakukan percobaan tanpa menggunakan enzim (non enzim) dengan kondisi reaksi yang sama. Sebagai data pembanding terhadap aktifitas Rhizomucor meihei, dilakukan percobaan dengan menggunakan asam palmitat dengan kondisi reaksi yang sama. Hasil screening biokatalis disajikan pada Tabel 6 berikut ini.
Tabel 6. Hasil Analisa Bilangan Asam untuk Screening Biokatalis BILANGAN ASAM (mmol/mg) KONVERSI (%) Waktu Reaksi (Jam) RM CA NE RM CA NE 0 132,72 132,72 0,00 0,00 0,00 4 108,71 130,93 18,08 1,35 2,74 8 100,13 119,24 24,55 10,15 5,78 12 93,71 116,11 29,38 12,52 11,20 16 89,69 113,18 32,42 14,72 13,83 20 80,04 111,87 39,69 15,70 14,17 24 75,61 110,40 132,72 129,07 125,04 117,85 114,35 113,97 113,54 43,02 16,81 14,45
Keterangan : RM : Rhizomucor meihei ; CA : Candida Antartica NE : Non Enzim 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 4 8 12 16 20 24
Waktu Reaksi (Jam)
Ko n v e rs i ( % ) Rhizomucor Meihei Candida Antartica Non Enzim
Besarnya konversi produk, ditentukan melalui selisih penurunan bilangan asam pada awal reaksi dengan bilangan asam selama reaksi berlangsung. Dari hasil percobaan screening biokatalis, diperoleh penurunan kandungan asam lemak bebas terbesar terdapat pada lipase Rhizomucor meihei (Lipozyme). Penentuan konversi produk dilakukan menggunakan selisih bilangan asam pada awal reaksi dengan akhir reaksi dibagi bilangan asam awal reaksi. Konversi produk dietanolamida yang diperoleh berkisar 43,02%, sedangkan untuk Candida antartica (Novozyme) diperoleh 16,81%. Sedangkan reaksi tanpa melibatkan enzim lipase (non enzim) memberikan perolehan produk sebesar 14,45% dan reaksi dengan asam palmitat memberikan perolehan konversi 49,92%. Hal ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh Elisabeth, dkk (1998) bahwa sifat spesifik yang dimiliki Rhizomucor meihei lebih besar pada asam lemak rantai panjang, dimana asam lemak yang dominan dalam asam lemak sawit distilat (ALSD) adalah C16 (asam palmitat).
Percobaan dengan menggunakan asam palmitat dengan menggunakan enzim Rhizomucor meihei memberikan konversi sebesar 49,92%. Kondisi ini semakin menegaskan bahwa Rhizomucor meihei mampu bekerja pada reaksi amidasi dengan substrat asam lemak sawit distilat (ALSD). Hasil analisa bilangan asam dapat dilihat pada Grafik 8 berikut ini. Dari hasil analisa FT-IR diketahui, bahwa bilangan gelombang dietanolamida dari asam palmitat berada pada 1627,24 cm-1 (ikatan C=O) dan 1419,87 cm-1 (ikatan C-N).
0 10 20 30 40 50 60 0 4 8 12 16 20 2
Waktu Reaksi (Jam)
K o n v er si ( % ) 4
Gambar 8. Perolehan Produk Dietanolamida Pada Substrat Asam Palmitat
Hasil analisa FT-IR terhadap dietanolamida dari asam palmitat terlampir pada Lampiran 6 (Gambar 29). Berdasarkan hasil yang diperoleh ditetapkan penggunaan lipase Rhizomucor meihei sebagai biokatalisator untuk percobaan selanjutnya.
4.1.2 Penentuan Waktu Reaksi
Pada umumnya, reaksi yang melibatkan katalis hayati (biokatalis) berlangsung dalam waktu reaksi yang cukup lama, hal ini berkaitan dengan kemampuan lipase untuk merombak atau mensintesa suatu substrat pada kondisi tertentu. Guna penentuan waktu reaksi adalah untuk mengetahui waktu terbaik yang dibutuhkan dalam sintesa dietanolamida. Percobaan dilakukan pada temperatur ruang (30oC), rasio mol 1:1 antara ALSD/dietanolamina dan konsentrasi Rhizomucor meihei 10% (b/b). Reaksi berlangsung selama 72 jam dan pengambilan sampel dilakukan dengan
interval waktu setiap 4 jam. Selama reaksi berlangsung dilakukan analisa bilangan asam untuk mengetahui konversi reaksi yang terjadi. Berikut adalah hasil percobaan.
Tabel 8. Hasil Analisa Bilangan Asam untuk Penentuan Waktu Reaksi WAKTU REAKSI (JAM) BILANGAN ASAM (mmol/g) KONVERSI (%) 0 132,72 0,000 4 108,71 18,08 8 100,13 24,55 12 93,71 29,38 16 89,69 32,42 20 80,04 39,69 24 75,61 43,02 28 73,20 44,84 32 71,59 46,05 36 64,75 51,21 40 63,55 52,12 44 62,74 52,72 48 62,34 53,03 52 62,25 53,09 56 62,15 53,17 60 62,11 53,20 64 61,13 53,18 68 62,25 53,09 72 62,08 53,21
0 10 20 30 40 50 60 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
Waktu Reaksi (Jam )
K o ( % ) si n v er
Gambar 9. Pengaruh Waktu Reaksi Terhadap Produk Dietanolamida
Pada waktu reaksi 24 jam, diperoleh produk sekitar 43,02% (kandungan bilangan asam 76,51 mmol/mg), dengan peningkatan waktu reaksi hingga 48 jam diperoleh kadar produk sebesar 53,03% (bilangan asam 62,34 mmol/mg). Bila waktu reaksi ditingkatkan hingga 72 jam, perolehan produk telah konstan pada kisaran 62,08%. Keadaaan ini menunjukkan bahwa aktifitas lipase Rhizomucor meihei mengalami penurunan yang nyata, bila waktu reaksi ditingkatkan lebih dari 48 jam. Penurunan aktifitas enzim lipase kemungkinan disebabkan oleh meningkatnya hasil samping berupa air dalam sistem reaksi. Dalam reaksi amidasi, keberadaan air akan memicu reaksi esterifikasi yang akan menyebabkan terbentuknya amina ester dalam produk akhir. Berdasarkan kondisi tersebut, maka untuk percobaan berikutnya ditetapkan waktu reaksi selama 24 jam dengan beberapa pertimbangan, yaitu :
1. Peningkatan waktu reaksi tidak memberikan perolehan produk yang nyata. Bila dibandingkan dengan waktu reaksi 24 jam, maka penambahan waktu reaksi hingga 48 jam hanya memberikan peningkatan produk sebesar 10,01%. Dari Gambar 9 terlihat bahwa pada waktu reaksi 52 jam hingga 72 jam, perolehan produk telah konstan. Hal dimungkinkan oleh telah menurunnya aktifitas enzim lipase untuk mesintesa substrat asam lemak sawit distilat. 2. Pemisahan asam lemak sawit distilat (reaktan yang tidak bereaksi) dari produk
cukup mudah, sehingga peningkatan waktu reaksi tidak menjadi faktor penting sebagai bahan pertimbangan untuk meningkatkan konversi produk. 3. Penentuan waktu reaksi dilakukan pada rasio mol 1:1, dengan justifikasi
bahwa peningkatan rasio substrat mampu meningkatkan perolehan produk maka waktu reaksi tidak menjadi satu-satunya faktor penentu reaksi amidasi. Penggunaan rasio substrat yang tinggi dibutuhkan untuk memperoleh ikatan peptida yang kuat pada produk.
4. Hasil analisa spektrofotomer infra red (FT-IR) menunjukkan bahwa peningkatan waktu reaksi hingga 48 jam dan 72 jam akan menyebabkan terbentuknya amina ester pada 1737,11 cm-1 (ikatan C-O) karena adanya kehadiran H2O dalam reaksi. Hasil analisa FT-IR terlampir pada Lampiran 6, (Gambar 26).
Dengan pertimbangan alasan di atas, waktu reaksi ditetapkan sebagai variabel tetap dalam reaksi amidasi asam lemak sawit distilat menjadi dietanolamida.
4.1.3 Pemilihan Pelarut
Berdasarkan studi literatur, diketahui bahwa aktifitas enzim turut dipengaruhi oleh keberadaan pelarut. Jenis pelarut yang digunakan haruslah dapat meningkatkan kelarutan asam lemak sawit distilat (ALSD) dengan dietanolamina. Sebab pada kondisi temperatur reaksi yang akan digunakan, asam lemak sawit distilat belum mencapai titik lelehnya. Titik leleh asam lemak sawit distilat berkisar 60oC. Penelitian pendahuluan dilakukan percobaan terhadap dua jenis pelarut organik yaitu n-heksana dan isopropanol, sebab asam lemak sawit distilat memiliki kelarutan yang baik pada pelarut organik. Tujuan dari pemilihan pelarut adalah untuk mengetahui performa pelarut yang terbaik bagi reaksi amidasi enzimatis antara ALSD dengan dietanolamina. Reaksi amidasi dilakukan dengan rasio mol 1:1 antara ALSD terhadap dietanolamina, konsentrasi biokatalis 10% dengan rasio pelarut 1:2 (b/v) antara ALSD/pelarut pada temperatur ruang (30oC). Berikut hasil penelitian untuk pelarut n- heksan dan isopropanol.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Heksan Isopropanol Jenis Pelarut K o n ver si ( % ) Enzim Non Enzim
Dari hasil perbandingan kedua jenis pelarut organik tersebut, diperoleh bahwa reaksi amidasi dengan melibatkan enzim lipase memberikan hasil yang baik pada pelarut n-heksana. Kondisi ini memperlihatkan bahwa aktifitas enzim lipase lebih baik terhadap pelarut organik yang bersifat hydrophobic (Gautam dan Tyagi, 2005). Pemilihan pelarut n-heksana juga didasarkan atas studi yang dilakukan oleh Rahman, dkk (2003) yang menyatakan bahwa n-heksana, benzena dan heptana merupakan pelarut yang memberikan hasil yang baik pada sintesa alkanolamida. Berdasarkan hasil penelitian perbandingan dan studi literatur, maka ditetapkan penggunaan heksan sebagai pelarut (solvent) dalam reaksi amidasi asam lemak sawit distilat menjadi dietanolamida menggunakan enzim lipase dengan beberapa alasan, yaitu :
1. Toksisitas n-heksana lebih rendah, bila dibandingkan dengan benzena dan heptana, diharapkan lebih aman dalam proses dan pemanfaatan produk
2. Penggunaan pelarut isopropanol, memungkinkan terjadinya reaksi esterifikasi antara asam lemak sawit distilat dengan isopropanol, sehingga kemungkinan terbentuknya senyawa amina ester semakin besar
3. n-Heksana bersifat inert, sehingga tidak mereduksi campuran produk
4. Recovery n-heksan dari campuran produk cukup mudah, sebab dalam proses purifikasi enzim lipase turut digunakan n-heksan sebagai bahan pencuci (untuk memisahkan asam lemak sisa reaksi)
5. n-Heksana lebih ekonomis, bila dibandingkan dengan benzena dan heptana sehingga tidak meningkatkan biaya produksi.
4.1.4 Penentuan Rasio Pelarut
Berdasarkan percobaan untuk penentuan jenis pelarut yang memberikan pengaruh positif terhadap perolehan dietanolamida, maka ditentukan n-heksana sebagai pelarut. Pelarut n-heksan yang digunakan memiliki kadar kemurnian 99%. Digunakannya n-heksan dalam reaksi ini, bertujuan untuk membantu kelarutan dari asam lemak sawit distilat (ALSD) terhadap dietanolamina. Karenanya akan timbul suatu asumsi, bahwa peningkatan rasio pelarut dapat meningkatkan kehomogenan substrat yang akhirnya diharapkan mampu memberikan perolehan produk yang baik. Untuk itu dibutuhkan penentuan rasio pelarut yang tepat untuk meningkatkan kelarutan, tetapi juga memberikan pengaruh positif terhadap kinerja Rhizomucor meihei. Percobaan dilakukan dengan rasio ALSD/n-heksana (b/v) adalah 1:1, 1:2, 1:3 dan 1:4 dan sebagai kontrol terhadap reaksi dilakukan percobaan dengan rasio pelarut yang sama tanpa menggunakan enzim lipase (non enzim). Berikut adalah hasil percobaan untuk penentuan rasio n-heksana.
0 5 15 20 25 30 35 40 45 50 1:1 1:2 1:3 1:4 Rasio n-Heksan (b/v) o si ( % ) Enzim n v er Non Enzim K 10
Dari hasil percobaan diketahui bahwa rasio ALSD terhadap pelarut 1:2 (b/v) memberikan performa terbaik. Hal ini dimungkinkan oleh peningkatan rasio pelarut yang menyebabkan keracunan (toksik) pada enzim lipase. Dapat dilihat pada rasio pelarut 1:3 dan 1:4, bahwa konversi yang diberikan untuk non enzim semakin meningkat dengan bertambahnya pelarut yang disebabkan oleh homogenitas campuran yang semakin tinggi. Berbeda dengan reaksi enzimatis yang mengalami penurunan, bahkan memberikan konversi yang hampir sama dengan non enzim (pada rasio 1:4). Kondisi ini menggambarkan bahwa lipase tidak aktif pada kondisi tersebut.
4.1.5 Pengaruh pH
Pada dasarnya enzim merupakan kumpulan protein. Seperti halnya protein, struktur ion enzim bergantung pada pH lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan ganda (zwitter ion). Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektifitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Disamping pengaruh struktur ion pada enzim, pH rendah atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. Pada kondisi tertentu, terdapat beberapa jenis enzim yang dapat bertahan pada kondisi alkalis. Untuk itu dibutuhkan suatu penelitian pendahuluan untuk mengetahui kemampuan lipase Rhizomucor meihei pada reaksi amidasi asam lemak sawit distilat ini. Percobaan dilakukan pada kondisi temperatur ruang (30oC), rasio mol 1:1
pH 6 – 7 maka reaksi akan di set-up pada pH tersebut untuk mengetahui aktifitas lipase terbaik. Untuk menurunkan pH awal digunakan H2SO4 dengan konsentrasi 15%. Sebagai kontrol reaksi enzimatis, dilakukan percobaan non enzim.
Berdasarkan hasil percobaan diketahui bahwa untuk pH 7 dan pH 6 aktifitas Rhizomucor meihei tidak menunjukkan aktifitas yang baik. Konversi pada reaksi enzimatis menunjukkan nilai minus, hal ini disebabkan oleh adanya reaksi esterifikasi yang bersifat reversibel oleh karena kehadiran H2SO4. Sedangkan reaksi dengan pH 8, menunjukkan aktifitas yang baik. Dari hasil percobaan pendahuluan ini, dapat disimpulkan bahwa lipase Rhizomucor meihei mampu bekerja pada reaksi amidasi dengan pH yang alkalis.
4.1.6 Penentuan Level Rhizomuor meihei
Percobaan amidasi asam lemak sawit distilat (ALSD) dengan menggunakan Rizhomucor meihei dilakukan pada 6 level konsentrasi biokatalis dalam persen berat (b/b) yaitu 6%, 8%, 10%, 12% dan 14% serta 0% (non enzim) sebagai kontrol reaksi. Percobaan tanpa menggunakan enzim ditujukan untuk mengetahui besarnya pengaruh yang dapat diberikan oleh lipase terhadap reaksi. Reaksi amidasi berlangsung selama 24 jam dengan rasio mol 1:1 antara asam lemak sawit distilat (ALSD) terhadap dietanolamina. Untuk menghemat penggunaan energi sebagian besar penelitian pendahuluan dilakukan pada temperatur ruang (30oC). Setelah waktu reaksi mencapai 24 jam dilakukan pengambilan sampel guna dianalisa bilangan asamnya. Hasil percobaan dapat dilihat pada tabel berikut dibawah ini.
Tabel 8. Pengaruh Level Konsentrasi Rhizomucor meihei Terhadap Produk Level Konsentrasi
R. meihei (b/b)
BILANGAN ASAM (mmol/g) Bilangan Asam Awal (mmol/g) = 132,72
KONVERSI (%) 6% 105,92 20.19 8% 92,81 30,07 10% 75,61 43,02 12% 101,20 23,74 14% 102,56 22,72 0 10 20 30 40 50 6 8 10 12 14
Level Rhizom ucor m eihei (% b/b)
Ko n v er si ( % )
Gambar 12. Pengaruh Level Konsentrasi Biokatalis Terhadap Dietanolamida
Perolehan produk terbaik terdapat pada konsentrasi 10%. Dari Gambar 12 ditunjukkan bahwa aktifitas enzim mengalami penurunan pada konsentrasi biokatalis yang lebih tinggi. Hal ini menggambarkan adanya batasan aktifitas enzim, karena terbatasnya substrat yang tersedia. Berdasarkan hasil di atas, ditetapkan konsentrasi biokatalis 10% sebagai nilai center point dalam desain response surface methodology
4.1.7 Penentuan Level Rasio Substrat
Dietanolamida dikenal sebagai foaming booster (peningkat busa) karena tingkat kepolaran yang dimilikinya lebih baik dari alkanolamida lain (Takaya dkk, 2004). Reaksi antara ALSD dengan dietanolamina dilakukan dengan menggunakan dietanolamina berlebih sehingga asam lemak sawit distilat berperan sebagai reaktan pembatas yang akan diobservasi. Percobaan dilakukan pada kondisi reaksi temperatur ruang (30oC), konsentrasi Rhizomucor meihei 10% selama 24 jam. Level rasio substrat yang digunakan adalah 1:1; 1:5; 1:10, 1:15 dan 1:20. Sebagai kontrol reaksi dilakukan percobaan tanpa enzim (non enzim) dengan rasio substrat yang sama.
Tabel 9. Pengaruh Rasio Substrat Terhadap Perolehan Dietanolamida BILANGAN ASAM (mmol/mg)
RASIO
ALSD:Dietanolamina
Awal Akhir
KONVERSI (%)
Non Enzim R.meihei Non Enzim R.meihei
1:1 132,72 113,54 75,61 14,45 43,02
1:5 127,95 84,08 72,19 34,28 43,57
1:10 118,61 76,71 61,69 35,32 47,98
1:15 112,11 66,52 66,21 40,66 40,94
1:20 30,08 20,86 22,33 30,65 25,75
Dari beberapa penelitian sebelumnya, diketahui bahwa penggunaan asam lemak berlebih akan meningkatkan senyawa amina ester yang terbentuk (Nuryanto, dkk., 2002). Sebab asam lemak yang excess tersebut akan bereaksi dengan gugus
hidroksil dari dietanolamina, membentuk amina ester. Sedangkan penggunaan alkanolamina yang berlebih turut dibutuhkan untuk pembentukan ikatan peptida (amida) yang efektif. Tetapi untuk setiap pembentukan satu ikatan peptida, akan dihasilkan satu molekul air, sehingga harus ditentukan rasio ALSD/dietanolamina yang tepat untuk memperoleh dietanolamida.
0 10 20 30 40 50 60 1:1 1:5 1:10 1:15 1:20
Ras io ALSD/Dietanolam ina
K o ( % ) No n enzim si n
ver Rhizo muco r meihei
Gambar 13. Pengaruh Rasio Substrat Terhadap Perolehan Dietanolamida
Pemilihan kondisi percobaan untuk menentukan level optimum rasio substrat merujuk pada percobaan yang dilakukan oleh Rahman, dkk (2003). Dari hasil percobaan diketahui perolehan produk terbesar pada rasio sustrat 1:10, sedangkan pada rasio 1:15 konversi produk mendekati non enzim. Sedangkan rasio 1:20 telah terjadi penurunan konversi produk dietanolamida yang nyata. Hal ini disebabkan oleh adanya hambatan oleh substrat yang terjadi karena substrat telah berikatan dengan
dengan hasil yang diperoleh oleh Rahman, dkk (2003), bahwa pada rasio substrat 1:15 hingga 1:20 perolehan produk telah konstan. Analisa FT-IR menunjukkan bahwa penggunaan dietanolamina berlebih pada reaksi non enzim dapat memicu kehadiran amina ester, tetapi pada reaksi enzimatis penggunaan dietanolamina berlebih tidak menunjukkan kehadiran amina ester. Hal ini disebabkan pada non enzim terdapat air sebagai hasil samping dari reaksi esterifikasi, sehingga kemungkinan terbentuknya amina ester semakin besar. Hasil percobaan ini menunjukkan adanya kemungkinan penggunaan konsentrasi substrat yang tinggi untuk meningkatkan konversi produk. Hasil analisa terlampir pada Lampiran 6 (Gambar 27)
4.1.8 Penentuan Level Temperatur
Percobaan pendahuluan untuk menentukan temperatur optimum yang akan digunakan sebagai titik center point dalam CCD dilakukan pada 4 level temperatur berbeda, yaitu 30oC, 40oC, 50oC dan 60oC. Pemilihan temperatur ini didasarkan pada keaktifan enzim lipase yang mampu bekerja pada kisaran temperatur 30oC-60oC (Reetz, 2002). Percobaan dilakukan dengan menggunakan rasio mol 1:1 dan biokatalis 10% (b/b). Penentuan level temperatur dilakukan untuk mengetahui level temperatur yang terbaik dari lipase Rhizomucor meihei pada reaksi amidasi. Sebagaimana diketahui bahwa peningkatan temperatur setiap 10oC akan meningkatkan kecepatan reaksi sebesar dua kali, sehingga diharapkan dengan kenaikan temperatur perolehan dietanolamida semakin besar (Wikipedia, 2007).
Tabel 10. Pengaruh Temperatur Terhadap Perolehan Dietanolamida Bilangan Asam (mmol/g)
Bilangan Asam (mmol/mg) = 132,72
KONVERSI (%) Temperatur
(oC)
Non Enzim R. meihei Non Enzim R. meihei
30 113,54 75,61 14,45 43,02 40 106,29 68,29 19,91 48,54 50 95,43 61,57 28,09 53,61 60 87,74 71,03 33,89 46,48 0 10 20 30 40 50 60 30 40 50 60 Tem peratur (C) K o n versi ( % ) Rhizomucor meihei Non Enzim
Gambar 14. Pengaruh Temperatur Terhadap Perolehan Produk
Dari Gambar 14 dapat diketahui bahwa untuk reaksi yang melibatkan Rhizomucor meihei, perolehan produk dietanolamida meningkat hingga temperatur 50oC, tetapi pada saat temperatur yang lebih tinggi digunakan (60oC), aktifitas lipase
reaksi non enzim semakin meningkat seiring dengan peningkatan temperatur. Hal ini disebabkan oleh semakin tingginya tumbukan antar partikel yang disebabkan oleh kenaikan temperatur sehingga mengaktifkan reaksi.
Dari analisa kromatografi lapis tipis (KLT), diketahui bahwa pada temperatur reaksi 60oC baik reaksi amidasi menggunakan enzim lipase atau non enzim akan menghasilkan produk samping berupa amina ester. Sedangkan pada temperatur yang lebih rendah (30oC – 50oC) tidak menunjukkan adanya pembentukan amina ester. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan temperatur akan berpengaruh pada pembentukan produk dietanolamida. Kenaikan temperatur mempengaruhi pemutusan ikatan hidroksil pada dietanolamina sehingga meningkatkan kuantitas H2O dan mempengaruhi aktifitas Rhizomucor meihei. Untuk reaksi amidasi ini, kehadiran H2O dalam kuantitas yang lebih besar selain akan mempengaruhi aktifitas enzim, juga akan memicu reaksi esterifikasi sehingga pada akhir produk akan diperoleh produk samping amina ester. Selain itu penuruanan konversi reaksi pada temperatur 60oC juga dimungkinkan oleh Rhizomucor meihei yang telah mengalami denaturasi pada temperatur tersebut. Hasil analisa KLT terlampir pada Lampiran 5 (Gambar 25).