BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Jalannya Penelitian
Pada penelitian penentuan profil isoezim esterase non-spesifik kali ini dilakukan dengan metode elektroforesis (O’Farrell, 1975 cit.Dharmawan, 1993), tahap-tahap penelitiannya meliputi:
1. Penyiapan larutan
a. Larutan penyangga elektroda disiapkan dengan cara :
Dibuat larutan stok, yaitu 0,005 M Tris-0,0384 M Glisin pH 8,3 (terdiri atas 0,05 M Tris (hidroksimetil) nitro metana sebanyak 6 gram dengan 0,384 M Glisin sebanyak 28,8 gram) dilarutkan dengan akuades sampai volume 1 liter. Bila akan digunakan larutan ini diencerkan 10 kali dengan akuades.
Larutan a adalah 1,5 M Tris-HCl (pH 8,9) yang dibuat dengan cara sebanyak 18,3 gram Tris dilarutkan dalam akuades dengan volume tertentu dan ditambah HCl hingga pH 8,9 dan volumenya 100 ml.
Larutan c adalah 30% akrilamida, yang dibuat dengan cara sebanyak 29,2 gram akrilamida 97,3% ditambah 0,8 gram N,N’-metilen bis(akrilamida) (BIS) 2,7% dilarutkan dengan akuades sampai volume 100 ml.
Larutan g adalah ammonium peroksidisulfat 10%, yang dibuat dengan cara sebanyak 1 gram ammonium peroksidisulfat, dilarutkan dalam akuades sampai volume 10 ml (selalu dibuat baru).
c. Larutan gel atas yang terdiri atas larutan b, d dan e
Larutan b adalah 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 yang dibuat dengan cara sebanyak 6,055 gram Tris, dilarutkan dengan sejumlah akuades dan ditambah HCl hingga pH 6,8 dan volumenya 100 ml.
Larutan d adalah akrilamida 12,5% yang dibuat dengan cara sebanyak 10 gram akrilamida 80% ditambah 2,5 gram bis-akrilamida 20% dan dilarutkan dengan akuades sampai volumenya 100 ml.
Larutan e adalah riboflavin, yang dibuat dengan cara sebanyak 4 mg riboflavin dilarutkan ke dalam akuades sampai volumenya 100 ml.
2. Pemasangan cetakan gel
Dua buah lempeng kaca diletakkan di atas meja dan permukaannya dibersihkan dengan tissue yang telah dibasahi dengan etanol. Sekat plastik dipasang pada sisi kanan dan kiri salah satu lempeng kaca. Sekat silikon dipasang sepanjang sisi kanan dan kiri di luar sekat plastik dan sisi bawah lempeng kaca.
Lempeng kaca yang lain ditutupkan ke atasnya sehingga sekat plastik terletak diantaranya. Pasangan ini ditegakkan di atas meja secara horizontal.
3. Penyiapan gel bawah
Pada penelitian ini gel bawah yang digunakan terdiri atas 10% akrilamida 0,375 M Tris-HCl pH 8,9 yang dibuat dengan cara :
Tabel I. Jumlah bahan yang digunakan dalam pembuatan gel bawah Banyaknya yang dibutuhkan untuk volume Bahan 15 ml 30 ml Larutan a Larutan c Akuades Larutan g Diaerasi TEMED 3,75 ml 5,00 ml 6,10 ml 0,15 ml 10 μl 7,50 ml 10,00 ml 12,50 ml 0,30 ml 20 μl
Larutan a, c, akuades dan larutan g dicampur dalam Erlenmeyer atau gelas ukur atau botol vakum bila akan dilakukan diaerasi. Larutan digojog dengan hati- hati, kemudian dilakukan dierasi dengan pompa vakum. Diaerasi dihentikan bila gelembung-gelembung yang terbentuk jumlahnya telah menjadi sedikit. Larutan ditambah TEMED dan digojog lagi dengan hati-hati, kemudian segera dituang dalam celah diantara lempeng kaca yang sudah disiapkan sampai kira-kira 2,5 cm sebelum batas atas lempeng kaca. Akuades ditambahkan ke atas gel untuk menutup permukaannya agar terbentuk permukaan yang datar air.
4. Penyiapan gel atas
Gel atas dibuat pada hari berikutnya setelah gel bawah selesai dipersiapkan. Komposisi gel atas dengan menggunakan 5% akrilamida 0,617 M Tris-HCl pH 6,7 adalah seperti yang tercantum pada Tabel II.
Larutan b, d, e dan akuades dicampur dalam botol vakum atau beker glass atau Erlenmeyer dan dilakukan diaerasi menggunakan pompa vakum. Larutan ditambah TEMED, dan dengan hati-hati digojog, selanjutnya dituang ke atas gel bawah setelah akuades di atasnya diambil. Sisir plastik dimasukkan dalam gel atas untuk membuat sumuran tempat sampel. Bila polimerasi sudah terjadi dengan sempurna (gel atas tampak putih), selanjutnya sisir plastik diambil dan kelebihan akuades yang ada dalam masing-masing sumuran dibersihkan menggunakan syringe.
Tabel II. Jumlah bahan yang digunakan dalam pembuatan gel atas Banyaknya yang dibutuhkan untuk volume Bahan 6,5 ml 13 ml Larutan b Larutan d Akuades Larutan e Diaerasi TEMED 0,78 ml 2,60 ml 2,09 ml 1,03 ml 4,70 μl 1,56 ml 5,20 ml 4,18 ml 2,06 ml 9,40 μl
5. Penyiapan homogenat nyamuk
Tabung ependrof diletakkan di atas hancuran es batu, kemudian ditetesi 75
memasukkan nyamuk ke dalam lemari es, dan dimasukkan dalam tabung ependrof tersebut, dihancurkan sampai halus dengan alat pellet pestle. Selanjutnya ke dalam tabung ependrof tersebut dimasukkan 75μl Triton-X 5% dan didiamkan selama 30 menit pada suhu 4°C. Homogenat disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 4 menit. Tabung efendrof yang berisi homogenat diletakkan kembali di atas hancuran es, kemudian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung efendrof baru. Supernatan ditambahkan 1 tetes indikator bromophenol blue dan dimasukkan dalam sumuran. Sebelumnya cetakan gel dipasang terlebih dahulu pada tempat elektroda.
6. Elektroforesis
Larutan penyangga dituang pada ruang bagian atas dan bawah tempat elektroda. Larutan penyangga di bagian atas harus menutupi seluruh permukaan sumuran gel atas yang telah berisi homogenat. Elektroforesis dilakukan kira-kira selama 2,5 jam pada tegangan 120 volt, kuat arus 30 mA, pada ruang dengan temperatur 4°C. Elektroforesis dianggap sudah cukup, bila mobilitas buffer penanda telah melewati 70-90% panjang gel. Setelah selesai, gel diambil dengan memisahkannya dari lempeng kaca dan dilanjutkan dengan proses pengecatan.
7. Pengecatan
Larutan substrat terdiri atas 20 mg α-naftil asetat dan 2 ml aseton. Untuk pencucian digunakan larutan penyangga 0,1 M buffer fosfat, pH 6,8 sebanyak 50 ml. Pada akhir elektroforesis gel dicuci dengan buffer fosfat selama 5 menit untuk menurunkan nilai pH. Selanjutnya buffer pencuci diganti dengan buffer fosfat
yang baru (25 ml) untuk inkubasi. Larutan substrat dimasukkan dan ditutup rapat- rapat. Inkubasi dilakukan dengan kondisi temperatur ruang antara 20-30°C selama 10 menit, sambil kadang-kadang digoyang.
Untuk pengecatan digunakan larutan yang terdiri atas akuades 10 ml, garam Fast Blue B sebanyak 45 mg dan 0,2 M buffer fosfat pH 6,8 sebanyak 10 ml. Pada akhir inkubasi, larutan substrat dibuang dan larutan untuk pengecatan dimasukkan dan inkubasi dilanjutkan kembali. Setelah gambaran pola esterase non-spesifik terbentuk dengan jelas dan baik, larutan untuk pengecatan dibuang dan gel dicuci dengan air beberapa kali sampai bersih untuk menghentikan reaksi. Gel segera difoto untuk mendapatkan gambar yang baik.