D. Metode Ekstraksi Bahan Alam
2. Jenis-jenis Ekstraksi
Proses ekstraksi dapat dilakukan secara panas dan secara dingin. Ekstraksi secara panas yaitu dengan metode refluks dan destilasi uap air, sedangkan ekstraksi dingin yaitu dengan maserasi, perkolasi dan soxhletasi (Sudjadi, 1988).
a. Ekstraksi Secara Maserasi
Maserasi adalah cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar.
Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan (Dirjen POM, 1986).
17 Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, strirak dan lain-lain.
Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air etanol atau pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian.
Keuntungan cairan penyari dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaan lama dan penyariannya kurang sempurna.
Pada penyarian dengan cara maserasi, perlu dilakukan pengadukan.
Pengadukan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan diluar butir serbuk simplisia, sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel.
Hasil penyarian dengan cara maserasi perlu dibiarkan selama waktu tertentu.
Waktu tersebut diperlukan untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut terlarut dalam cairan penyari seperti malam dan lain-lain (Dirjen POM, 1986).
Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya : 1) Digesti
Digesti adalah maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah, yaitu pada suhu 40o-50o C. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan untuk simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan.
Dengan pemanasan akan diperoleh keuntungan antara lain :
a) Kekentalan pelarut berkurang, yang dapat mengakibatkan berkurangnya lapisan-lapisan batas.
b) Daya melarutkan cairan penyari akan meningkat, sehingga pemanasan tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolute dan berbanding terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu dinaikkan. Jika cairan penyari mudah menguap pada suhu yang digunakan, maka perlu dilengkapi dengan pendingin balik.
2) Maserasi dengan mesin pengaduk
Penggunaan mesin pengaduk yang berputar terus menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6 sampai 24 jam.
3) Remaserasi
Cairan penyari dibagi 2. Seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienap tuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari yang kedua.
4) Maserasi melingkar
Maserasi dapat diperbaiki dengan mengusahakan agar cairan penyari selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini penyari selalu bergerak dan menyebar.
Dengan cara ini penyari selalu mengalir kembali secara berkesinambungan melalui serbuk simplisia dan melarutkan zat aktifnya.
19 Keuntungan cara ini adalah :
a) Aliran cairan penyari mengurangi lapisan batas
b) Cairan penyari akan secara seragam, sehingga akan memperkecil kepekatan setempat
c) Waktu yang diperlukan lebih pendek.
5) Maserasi melingkar bertingkat
Pada maserasi melingkar penyarian tidak dapat dilaksanakan secara sempurna, karena pemindahan massa akan berhenti bila keseimbangan telah terjadi. Masalah ini dapat diatasi dengan maserasi melingkar bertingkat (Dirjen POM, 1986).
b. Ekstraksi Secara Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.
Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut :
Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang dibagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas kebawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak kebawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan diatasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan. Kekuatan yang berperang pada perkolasi antara lain: Gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adesi, daya kapiler dan daya geseran (Friksi).
Cara perkolasi lebih baik dibandingkan cara maserasi karena :
a. Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi.
b. Ruangan di antara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut, maka kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat meningkatkan perbedaan konsentrasi.
Alat yang digunakan untuk perkolasi desebut perkolator. Cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum. Larutan zat aktif yang keluar dari perkulator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah dilakukannya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi. Bentuk perkolator ada 3 macam yaitu perkolator berbentuk tabung, perkolator berbentuk paruh, dan perkolator berbentuk corong. Pemilihan perkolator tergantung pada jenis serbuk simplisia yang akan disari. Pada pembuatan tingtur dan ekstrak cair, jumlah cairan penyari yang tersedia lebih besar dibandingkan jumlah cairan penyari yang diperlukan untuk melarutkan zat aktif. Pada keadaan tersebut, pembuatan sediaan digunakan perkolator lebar untuk mempercepat proses perkolasi (Dirjen POM, 1986).
1. Reperkolasi
Untuk menghindari kehilangan minyak atsiri pada pembuatan sari, maka cara perkolasi diganti dengan cara reperkolasi. Pada perkolasi dilakukan pemekatan sari dengan pemanasan. Pada reperkolasi tidak dilakukan pemekatan. Reperkolasi
21 dilakukan dengan cara: simplisia dibagi dalam beberapa perkolator pertama dipisahkan menjadi perkolat 1 dan sari selanjutnya disebut susulan 2. Susulan 2 digunakan untuk menyari perkolator 2. Hasil perkolator kedua dipisahkan menjadi perkolat dua dan sari selanjutnya disebut susulan 2. Pekerjaan tersebut diulang sampai mendapat perkolat yang diinginkan. Untuk cara reperkolasi dapat dilakukan pada herba timi.
a) Perkolasi bertingkat
Dalam proses perkolasi biasa, perkolat yang dihasilkan tidak dalam kadar yang maksimal. Selama cairan penyari melakukan penyarian serbuk simplisia, maka terjadi aliran melalui lapisan serbuk dari atas sampai kebawah disertai pelarutan zat aktifnya. Proses selanjutnya tersebut akan menghasilkan perkolat yang pekat pada tetesan pertama dan pada tetesan terakhir akan diperoleh perkolat yang encer.
Untuk memperbaiki cara perkolasi tersebut dilakukan cara perkolasi bertingkat. Serbuk simplisia yang hampir tersari sempurna. Sebaliknya serbuk simplisia yang baru, disari dengan perkolat jenuh. Dengan demikian akan diperoleh perkolat akhir yang jenuh. Perkolat dipisahkan dan dipekatkan.
Cara ini cocok jika digunakan untuk perusahaan obat tradisional, termasuk perusahaan yang memproduksi sediaan galenik. Agar diperoleh cara yang tepat, perlu dilakukan percobaan pendahuluan. Dengan percobaan tersebut dapat ditetapkan:
1) Jumlah perkolator yang diperlukan
2) Bobot serbuk simplisia untuk tiap kali perkolasi 3) Jenis cairan penyari
4) Jumlah cairan penyari untuk tiap kali perkolasi 5) Besarnya tetesan dan lain-lain.
Perkolator yang digunakan untuk cara perkolasi ini agak berlainan dengan perkolator biasa. Perkolator ini harus dapat diatur sehingga:
a) Perkolat dari suatu perkolator dapat dialirkan ke perkolator lainnya b) Ampas dengan mudah dapat dikeluarkan (Dirjen POM, 1986).
c. Ekstraksi Secara Refluks
Proses yang diuraikan dimuka adalah proses untuk menghasilkan ekstrak cair, yang akan dilanjutkan dengan proses diatas. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, penyari akan naik keatas melalui serbuk simplisia tiap penyari akan mengembun karena didinginkan oleh pendingan balik embun turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu cairan akan menguap kembali berulang proses seperti diatas (Dirjen POM, 1986).
Keuntungan:
a. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit, dan secara langsung diperoleh hasil yang lebih pekat.
b. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni, sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.
c. Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa menambah volume cairan penyari.
23 Kerugian:
a. Larutan dipanaskan terus menerus, sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok. Ini dapat diperbaiki dengan menambah peralatan untuk mengurangi tekanan udara.
b. Cairan penyari dididihkan terus menerus, sehingga cairan penyari yang baik harus murni atau campuran azeotrop (Dirjen POM,1986).
d. Ekstraksi Secara Destilasi Uap
Destilasi uap dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia yang mengandung komponen yang mempunyai titik didih pada tekanan udara normal. Pada pemanasan biasa kemungkinan akan terjadi kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut maka penyarian dilakukan dengan destilasi uap.
Dengan adanya uap zat air yang masuk, maka tekanan kesetimbangan uap zat kandungan akan diturunkan menjadi sama dengan tekanan bagian dalam sistem, sehingga produk akan terdestilasi dan terbawa oleh uap air yang mengalir. Destilasi uap bukan semata-mata suatu proses penguapan pada titik didihnya, tetapi suatu proses perpindahan massa ke suatu media yang bergerak. Uap jenuh yang membasahi permukaan bahan, melunakkan jaringan dan menembus ke dalam melalui dinding sel dan zat aktif akan pindah ke rongga uap air yang aktif dan selanjutnya akan pindah ke rongga uap yang bergerak melalui antar fase. Proses ini disebut hidrodifusi (Dirjen POM, 1986).
e. Infundasi
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 90oC selama 15 menit. Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam.
Cara ini sangat sederhana dan sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional. Dengan beberapa modifikasi, cara ini sering digunakan untuk membuat ekstrak.
Infus dibuat dengan cara:
a. Membasahi bahan bakunya, biasanya dengan air 2 kali bobot bahan, untuk bunga 4 kali bobot bahan dan untuk keragen 10 kali bobot bahan.
b. Bahan baku ditambah dengan air dan dipanaskan selama 15 menit pada suhu 90o -98o C. Umumnya untuk 100 bagian sari diperlukan 10 bagian bahan.
c. Untuk memindahkan penyarian kadang-kadang perlu ditambah bahan kimia misalnya:
1) Asam sitrat
2) Kalium atau natrium karbonat
3) Penyarian dilakukan pada saat cairan masih panas, kecuali bahan yang mengandung bahan yang mudah menguap (Dirjen POM, 1986).
25 E. Toksisitas
Toksisitas adalah efek berbahaya dari suatu bahan obat pada organ target. Uji toksisitas dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan zat yang akan diuji. Adapun sumber zat toksik dapat berasal dari bahan alam maupun sintesis (Anonim, 2011).
Toksisitas diidentifikasikan sebagai kemampuan suatu zat untuk menimbulkan kerusakan. Toksisitas merupakan kemampuan racun untuk menimbulkan kerusakan apabila masuk ke dalam tubuh atau organ yang rentan terhadapnya (Soemirat, 2009).
Toksisitas merupakan suatu sifat relatif dari zat kimia dan sejauh menyangkut diri manusia secara langsung maupun tidak langsung. Toksisitas selalu menunjukkan ke suatu efek berbahaya atau mekanisme biologi tertentu. Toksisitas merupakan istilah relatif yang biasa dipergunakan dalam membandingkan suatu zat kimia lebih toksik dari zat kimia lainnya. Perbandingan antara zat kimia seperti itu sangat tidak informatif, kecuali jika pernyataan itu melibatkan informasi tentang mekanisme biologi yang sedang dipermasalahkan dan juga dalam kondisi bagaimana zat kimia tersebut berbahaya. Karena itu, pendekatan toksikologi adalah dari segi tentang berbagai efek zat kimia atas berbagai sistem biologi dengan penekanan pada sistem mekanisme efek berbahaya zat kimia itu dan kondisi dimana efek berbahaya itu terjadi. Kematian merupakan salah satu diantara beberapa kriteria toksisitas. Salah satu caranya ialah menggunakan senyawa dengan dosis maksimal, kemudian kematian hewan uji dicatat. Angka kematian hewan dihitung sebagai harga median Lethal Dose (LD50) atau median Lethal Concentration (LC50).
Toksisitas diukur dengan mengamati kematian pada hewan coba. Kematian merupakan salah satu diantara beberapa kriteria toksisitas. Salah satu caranya ialah menggunakan senyawa dengan dosis maksimal, kemudian kematian hewan uji dicatat. Dengan adanya kenyataan bahwa beberapa zat kimia akan menimbulkan kematian dalam dosis mikrogram, maka zat kimia seperti itu biasanya dianggap sebagai sangat toksik (beracun) zat kimia yang lain mungkin relatif kurang berbahaya setelah diberikan dengan dosis yang melebihi beberapa gram karena mungkin banyak kisaran kadar atau dosis berbagai zat kimia yang menghasilkan bahaya, maka telah dirumuskan penggolongan toksisitas atas dasar jumlah besarnya zat kimia yang diperlukan untuk menimbulkan bahaya.
Suatu contoh penggolongan tersebut yaitu (Loomis, 1978):
a. Luar biasa toksik (1 mg/Kg atau kurang) b. Sangat toksik (1-59 mg/Kg)
c. Cukup (50-500 mg/Kg) d. Sedikit (0,5-5 mg/Kg)
e. Praktis tidak toksik (5-15 mg/Kg)
f. Relatif kurang berbahaya (lebih dari 15 g/Kg)
Penggolongan ini hanya berlaku untuk harga LD50 pada hewan percobaan untuk harga LC50 hanya dibedakan menjadi (Meyer et al., 1982):
a. Toksik (LC50 < 1000 µg/ml) b. Tidak toksik (LC50 > 1000 µg/ml)
27 Meyer, et al., (1982) menyatakan bahwa senyawa uji dikatakan toksik jika harga LC50 lebih kecil dari 1000 μg/mL. Penentuan potensi bioaktif dilakukan dengan membandingkan nilai LC50 masing-masing ekstrak dengan ketentuan McLaughin (1991):
a. LC50 < 30 ppm ekstrak berpotensi sebagai antikanker (sitotoksik) b. LC50 30-200 ppm ekstrak berpotensi sebagai anti mikroba
c. LC50 200-1000 ppm ekstrak berpotensi sebagai pestisida
Taraf toksisitas dapat digunakan untuk menilai toksisitas suatu racun yang sedang diuji coba pada berbagai organisme. Tetapi toksisitas ini sangat beragam bagi berbagai organisme, tergantung dari beberapa faktor antara lain (Soemirat, 2009) :
1. Spesies uji
2. Cara racun memasuki tubuh 3. Frekuensi dan lamanya paparan 4. Konsentrasi zat pemapar
5. Bentuk, sifat kimia/fisika zat pencemar
6. Kerentanan berbagai spesies terhadap pencemar
Ada 2 jenis sifat toksik, yakni reversible dan irreversible. Ciri-ciri efek toksik reversible meliputi (Priyanto, 2009) :
1. Bila jumlah zat toksik dalam tempat kerjanya atau reseptornya telah habis, maka reseptor akan kembali seperti keadaan semula.
2. Efek toksik yang diakibatkan akan cepat hilang atau kembali ke normal.
3. Ketoksikan sangat tergantung pada dosis, kecepatan absorpsi, distribusi, dan eliminasi zat racun.
Sedangkan ciri-ciri dari sifat efek toksik yang irreversible adalah (Priyanto, 2009):
1. Kerusakan yang terjadi sifatnya permanen.
2. Paparan berikutnya akan menimbulkan kerusakan yang sifatnya sama sehingga memungkinkan terjadinya akumulasi efek toksik.
3. Paparan dengan takaran yang sangat kecil dalam jangka panjang akan menimbulkan efek toksik yang sama efektifnya dengan yang ditimbulkan oleh paparan dosis besar jangka pendek. Ini menunjukkan zat yang dapat menimbulkan efek toksik irreversible adalah zat racun yang terakumulasi atau sangat sukar dieliminasi.
Uji toksisitas dibagi 2 golongan yaitu uji toksisitas tak khas (akut, subkronis dan kronis) dan uji toksisitas khas yang meliputi potensi teratogenik, mutagenik dan karsinogenik.
a. Uji Toksisitas Akut.
Uji ini dirancang untuk menentukan efek toksik suatu senyawa yang akan terjadi dalam masa pemejanan dengan waktu yang singkat atau pemberiannya dengan takaran tertentu. Uji ini dilakukan dengan cara pemberian konsentrasi tunggal senyawa uji pada hewan uji. Takaran konsentrasi yang dianjurkan paling tidak empat peringkat konsentrasi, berkisar dari konsentrasi terendah yang tidak atau hampir tidak mematikan seluruh hewan uji sampai dengan konsentrasi tertinggi yang dapat
29 mematikan seluruh atau hampir seluruh hewan uji. Biasanya pengamatan dilakukan selama 24 jam, kecuali pada kasus tertentu selama 7-14 hari.
b. Uji Toksisitas Subkronis atau Subakut
Dilakukan dengan memberikan zat kimia yang sedang diuji tersebut secara berulang-ulang terhadap hewan uji selama kurang dari 3 bulan. Uji ini ditujukan untuk mengungkapkan spektrum efek toksik senyawa uji, serta untuk melihatkan apakah spektrum toksik itu berkaitan dengan takaran konsentrasi.
c. Uji Toksisitas Kronis
Dilakukan dengan memberikan zat kimia secara berulang-ulang pada hewan uji selama lebih dari 3 bulan atau sebagian besar dari hidupnya. Meskipun pada penelitian digunakan waktu lebih pendek, tetapi tetap lebih lambat dibandingkan Uji Toksisitas Akut maupun Uji Toksisitas Sub Akut.
Belakangan ini telah banyak pengujian tentang toksisitas yang dikembangkan untuk pencarian produk alam yang potensial sebagai bahan antineoplastik. Metode pengujian tersebut antara lain Simple Brench-Top Bioassy (terdiri dari Brine Shrimp Lethality test, Lemna Minor Bioassy dan Crown-Gall Potato disc bioassay) dan pengujian pada sel telur Bulubabi.
Dengan berdasarkan pemikiran bahwa efek farmakologi adalah toksikologi sederhana pada dosis yang rendah dan sebagian besar senyawa antitumor adalah sitotoksik, maka Brine Shrimp Lethality Test dapat digunakan sebagai uji pendahuluan senyawa antitumor. Senyawa yang mempunyai kemampuan membunuh sel kanker dalam kultur sel. Pengujian ini adalah pengujian letalitas yang sederhana
dan tidak spesifik untuk aktifitas tumor, tetapi merupakan indikator toksisitas yang baik dan menunjukan korelasi yang kuat dengan pengujian antitumor lainnya seperti uji sitotoksitas dan uji leukemia tikus. Karena kesederhanaan prosedur pengerjaan, biaya yang rendah serta korelasinya terhadap pengujian toksisitas dan pengujian antitumor menjadikan Brine Shrimp Lethality Test sebagai uji hayati pendahuluan untuk aktifitas antitumor yang sesuai dan dapat dilakukan secara rutin di Laboratorium dengan fasilitas sederhana. Uji toksisitas sebagai skrining awal dapat dilakukan dengan berbagai metode antara lain adalah metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Metode BST adalah suatu metode uji guna untuk menentukan toksisitas suatu senyawa bahan alam dengan cepat, murah dan cukup akurat untuk penapisan ekstrak bahan aktif dengan menggunakan hewan uji Artemia Salina Leach yang berumur 48 jam.