Tanaman kayu manis merupakan tanaman Famili Lauraceae dan Genus Cinnamomum yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Tanaman kayu manis memiliki kandungan metabolit sekunder salah satunya untuk aktivitas antidiabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa sinamaldehid yang terkandung dan menentukan aktivitas antidiabetes tertinggi dari ekstrak kulit batang kayu manis dengan uji penghambatan enzim α-glukosidase. Metode penelitian ini meliputi proses maserasi kulit batang kayu manis dengan pelarut etanol 96% dan metanol 96%, kemudian skrining uji aktivitas antidiabetes dengan metode penghambatan enzim α-glukosidase. Salah satu ekstrak yang memiliki aktivitas antidiabetes tertinggi dianalisis lanjut dengan cara Kromatografi Lapis Tipis kemudian dilakukan fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan dilanjutkan dengan analisis Kromatografi Lapis Tipis Preparatif. Fraksi yang paling aktif diidentifikasi senyawa sinamaldehidnya menggunakan instrumen spektrofotometer UV, spektrofotometer FT-IR, KG-MS. Berdasarkan hasil penelitian, skrining ekstrak etanol kulit batang kayu manis memiliki aktivitas antidiabetes tertinggi dengan nilai % inhibisi sebesar 60 %. Fraksi teraktif dari ekstrak etanol hasil fraksinasi pertama (fraksi 1) sebesar 45.73 ppm dan fraksinasi kedua (fraksi 1.2) sebesar 30,74 ppm. Fraksi 1.2 dilakukan pemisahan kembali dengan KLT preparatif dan dihitung nilai Rf nya yang mendekati nilai Rf
sinamaldehid dianalisis dengan UV-Vis, FT-IR, dan KG-MS sehingga diperoleh senyawa yang berpotensi sebagai antidiabetes diduga senyawa 2-propenal,3-fenil.
Kata kunci: kayu manis (Cinnamomum burmannii), enzim α-glukosidase, antidiabetes, sinamaldehid, dan 2-propenal,3-fenil.
ABSTRACT
Cinnamon plants are plants of the Lauraceae Family and the Genus Cinnamomum is widely cultivated in Indonesia. Cinnamon plant was utilized as diabetic treatment. This study aims to determine the highest antidiabetic activity and to identify cinnamaldehyde from cinnamon stem bark extract by inhibiting the α-glucosidase enzyme. This research method contains the maceration process of cinnamon stem bark with ethanol 96% and methanol 96%, screening for antidiabetic activity by inhibiting the α-glucosidase enzyme. Extracts with highest antidiabetic activity was analyzed by thin layer chromatography and fractionated with column chromatography and preparative thin layer chromatography. The most active fraction was identified its cinnamaldehyde compound using UV spectrophotometer, FT-IR spectrophotometer, GCMS. Based on the results of the study, the ethanol extract of cinnamon stem bark had the highest antidiabetic activity with percentage inhibition was 60%.
The most active fraction from the first fractionated ethanol extract (fraction 1) and second fractionation (fraction 1.2) were 45.73 ppm and 30.74 ppm respectively. Fraction 1.2 was calculated the Rf value that similar to cinnamaldehyde Rf values, fractionated using preparative TLC and analyzed by UV-Vis, FT-IR, and GCMS so that the antidiabetic compound interpreted as 2-propenal, 3-phenyl.
Keywords: cinnamon (Cinnamomum burmannii), α-glucosidase enzyme, antidiabetic, cinnamaldehyde, and 2-propenal, 3-phenyl
49
PENDAHULUAN
Diabetes mellitus (DM) merupakan gangguan metabolisme glukosa yang ditandai dengan peningkatan kadar gula darah dan berhubungan dengan komplikasi akut maupun kronis(1). Untuk memperkecil resiko parahnya penyakit dan menurunkan resiko komplikasi diabetes melitus, maka perlu penanganan secara disiplin (Dirjen Bina Kefarmasian dan alat Kesehatan, 2005). Pengobatan diabetes meliputi pengendalian berat badan, olahraga dan diet. Tetapi kebanyakan penderita merasa kesulitan untuk melakukannya sehinggapengobatan diabetes melitus dapat dilakukan dengan pemberian insulin, obat hipoglikemik oral, dan obat herbal (2).Salah satu tanaman tradisional yang dapat dijadikan obat herbal penyakit diabetes melitus adalah tanaman kayu manis (3)
Beberapa peneliti telah berhasil mengisolasi senyawa sinamaldehid yang memiliki aktivitas antidiabetes. Prasetya dan Ngadiwiyana, (2006) berhasil mengidentifikasi senyawa dari minyak kulit batang kayu manis Cinnamomum casia yaitu senyawa sinamaldehid dengan waktu retensi 7,619 menit dan kelimpahannya sebesar 91,18%. Penelitian terhadap potensi sinamaldehid hasil isolasi dari minyak kayu manis mempunyai nilai IC50 sebesar 27,96 ppm terhadap enzim α-glukosidase sehingga sangat potensial sebagai senyawa penghambat aktivitas antidiabetes (4). Senyawa sinamaldehid telah berhasil diisolasi dari kulit batang kayu manis Cinnamomum burmanii berdasarkan nilai Rf fraksi yang mendekati nilai Rf standar sinamaldehid, hasil analisis GCMS memiliki kelimpahan sebesar 71,36%, waktu retensi 9,289 menit dan nama senyawa 2-propenal, 3-phenyl- (CAS) Cinamaldehyde)(5)
BAHAN DAN METODE BAHAN
Kulit batang kayu manis dari Gunung Mas, etanol 96%, metanol 96%, enzim ɑ-glukosidase, buffer fosfat 0,1M, buffer fosfat 0,01M, p-nitrofenil-ɑ-D-glukopiranose, tablet akarbose, Na2CO3 0,2M, DMSO 99%, DMSO 1%, etil asetat, n-heksan, diklorometan, etil asetat pro analisis, HCl 2N, silika gel GF254, celite 545
.
METODE.
Preparasi sampel
Sampel kulit batang kayu manis yang telah dipotong-potong masing-masing ditimbang sebanyak 100 gram dan diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 3.900 mL dan pelarut metanol 96% sebanyak 3.750 mL dalam keadaan terpisah, sesekali dikocok dan dibiarkan terendam selama 1 hari pada suhu kamar. Setelah 1 hari dilakukan penyaringan, filtrat yang dihasilkan ditampung dalam botol 1L dan dilakukan pengulangan sebanyak 13 kali maserasi hingga ekstraksi sempurna ditandai dengan warna filtrat yang telah memudar. Hasil maserasi ekstrak etanol dan metanol kemudian diuapkan menggunakan rotary vacum evaporator pada suhu 50℃ hingga diperoleh ekstrak kental etanol dan ekstrak kental metanol. Masing-masing ekstrak ditampung dalam botol kaca dan dikeringkan dengan cara dikeringanginkan
Uji Aktivitas Antidiabetes
Penentuan Aktivitas antidiabetes menggunakan metode penghambatan enzim α-glukosidase dengan modifikasi Saijyo(6) . Sampel dilarutkan DMSO 1 % dibuat variasi konsentrasi 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan 250 ppm. Absorbansi diukur spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 400 nm. Kontrol positif tablet dilarutkan menggunakan HCl: buffer fosfat 0,1 (1:1).
50
Persen hambat (% inhibisi) dengan menggunakan persamaan berikut:
% hambat =
% hambat = Keterangan:
C = Absorbansi kontrol (C1 – C0)
A = Absorbansi aktivitas enzim pada kontrol positif (A1 – A0)
S = Absorbansi aktivitas enzim dengan penambahan sampel uji (S1 – S0)
Selanjutnya ditentukan nilai IC50. Persamaan regresinya y = ax + b yang diperoleh, dengan persamaan:
Fraksinasi Dengan Kromatografi Kolom dan KLT Preparatif
Ekstrak etanol dengan aktivitas antidiabetes tertinggi dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan hasil optimasi KLT. Fase gerak menggunakan sistem gradien yaitu n-heksan : etil asetat(10:1)~(1:1) dilanjutkan dengan diklorometan : metanol (10:1) ~ (1:1). Fraksi yang memiliki pola KLT sama digabungkan menjadi satu, sehingga memperoleh fraksi yang lebih sederhana. Fraksinasi kedua dilakukan kromatografi kolom dengan sistem gradien yaitu n-heksan : etil asetat(10:1) (5:1) (1:1) dilanjutkan dengan diklorometan : metanol (10:1) (5:1). Fraksi yang memiliki pola KLT sama digabungkan menjadi satu, sehingga memperoleh fraksi yang lebih sederhana. Fraksi teraktif hasil kromatografi kolom kedua dilakukan pemisahan kembali menggunakan KLT preparatif. Fraksi 1.2 dilarutkan menggunakan etil asetatkemudian ditotolkan pada lempeng silika gel GF254dalam bentuk pita dan dieluasi dengan eluen diklorometan-metanol (20:1) hingga batas atas. Pita kromatogram yang terbentuk dilihat dibawah sinar ultraviolet panjang gelombang 254 nm dan diberi tanda mengikuti pola kromatogram yang terbentuk. Kemudian pita yang dominan tersebut dikerok ditampung ke dalam vial, dilarutkan menggunakan etil asetat pro analisis, disaring menggunakan kertas penyaring whattman filtrat ditampung dalam vial yang telah ditimbang terlebih dahulu, kemudian diuapkan hingga kering dan ditimbang bobot akhirnya sehingga diperoleh isolat 1.2.
Identifikasi Senyawa
Fraksi teraktif hasil pemurnian dengan KLT preparatif diidentifikasi senyawa kimianya menggunakan menggunakan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 200-800 nm, spektrofotometri FTIR pada bilangan gelombang 400-4000 cm-1 dan Kromatografi Gas - Spektrofotometri Massa (KG-MS)
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Skrinining Aktivitas Antidiabetes
Ekstraksi kulit batang kayu manis dilakukan secara maserasi, menggunakan pelarut etanol 96% dan pelarut metanol 96%. Proses maserasi dipilih karenacara ekstraksi yang pengerjaannya sederhana, menggunakan peralatan yang sederhana, dan menghindari terjadinya kerusakan senyawa-senyawa organik didalam sampel karena adanya proses pemanasan. Nilai rendemen dari masing-masing ekstrak yang disajikan pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil ekstrak kental dan nilai rendemen kulit batang kayu manis Pelarut Ekstrak kental Rendemen
Etanol 23,62 gram 23,62 % Metanol 23,04 gram 23,04 %
51
Ekstrak etanol memiliki nilai rendemen lebih besar karena etanol merupakan pelarut universal, dapat menarik lebih banyak senyawa yang berada pada sampel dibandingkan pelarut metanol.
Kemudian dilakukan skrining penghambatan enzim α-glukosidase secara in vitro dengan tujuan memilih salah satu ekstrak yang mempunyai aktivitas antidiabetes tertinggi dan akan dianalisis lebih lanjut, disajikan pada tabel 2.
Tabel 2. aktivitas antidiabetes ekstrak kulit batang kayu manis Pelarut Konsentrasi % inhibisi
Etanol 100 ppm 60 %
Metanol 100 ppm 58 %
Hasil uji aktivitas antidiabetes menunjukkan ekstrak etanol pelarut yang lebih banyak menarik senyawa dan ekstrak yang lebih aktif dalam menghambat enzim α-glukosidase.
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom dan Uji Aktivitas Antidiabetes Hasil fraksinasi
Pemisahan kromatografi kolom sebanyak 20 gram ekstrak etanol 96% kulit batang kayu manis menggunakan sistem gradien, fase diam silika gel dan fase gerak variasi perbandingan n-heksan : etil asetat (10:1)~(1:1) dilanjutkan diklorometan : metanol (10:1)~(1:1). Hasil fraksinasi ditampung dalam vial sebanyak 225 fraksi, kemudian fraksi-fraksi tersebut disederhanakan dengan KLT. Setiap fraksi yang memiliki pola kromatogram sama digabungkan kembali sehingga memperoleh 7 fraksi.
Selanjutnya, setiap fraksi di uji aktivitas antidiabetesnya berdasarkan nilai IC50 terhadap enzim α-glukosidase untuk menentukan fraksi yang paling aktif sebagai antidiabetes. Nilai IC50 masing-masing fraksi dapat dilihat dalam bentuk grafik pada Gambar 1. Hasil IC50 fraksi 1 sebesar 45,73 ppm, menunjukkan bahwa fraksi 1 merupakan fraksi teraktif, tetapi masih memiliki beberapa spot noda yang belum murni maka dilakukan pemurnian menggunakan kromatografi kolom kedua. Pemisahan fraksi 1 menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (10:1) digunakan pada fraksinasi kedua karena pemisahannya tidak terlalu cepat sehingga diharapkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak dapat terpisah dengan baik. Pemisahan fraksinasi kedua dilakukan sebanyak 0,49 gram fraksi 1 untuk dipemisahkan kembali dengan kromatografi kolom kedua menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksan : etil asetat (10:1) (5:1) (1:1) dilanjutkan diklorometan : metanol (10:1) (5:1). Hasil fraksinasi ditampung dalam vial sebanyak 137 fraksi kemudian disederhanakan kembali sehingga memperoleh 4 fraksi. Ke empat fraksi kemudian dilakukan uji aktivitas antidiabetes berdasarkan nilai IC50 terhadap enzim α–glukosidase. Nilai IC50 masing-masing fraksi dapat dilihat dalam grafik pada Gambar 2.
Gambar 1. Nilai IC50 fraksi kromatografi kolom 1 Gambar 2. Nilai IC50 fraksi kromatografi kolom 2
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7
IC50 45,73 47,47 46,54 109,6 61,01 47 46,54 Nilai IC50(ppm)
Fraksi
F1.1 F1.2 F1.3 F1.4
IC50 40,36 30,74 42,37 54,25
IC50(ppm)
52
Aktivitas antidiabetes fraksi 1.2 dan tablet akarbose sebagai kontrol positif
Fraksinasi kedua menghasilkan fraksi 1.2 memiliki nilai aktivitas tertinggi dan tablet akarbose digunakan sebagai kontrol positif untuk membandingkan aktivitas antidiabetes fraksi teraktif dengan kontrol positifnya. Dari hasil pengujian aktivitas antidiabetes, nilai IC50 fraksi 1.2 sebesar 30,74 ppm dan nilai IC50 tablet akarbose sebesar 9,17 ppm. Nilai IC50 fraksi 1.2 dan tablet akarbose termasuk kedalam golongan senyawa sangat aktif karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm (7). Perbedaan nilai IC50 terjadi karena fraksi 1.2 merupakan identifikasi senyawa yang memiliki aktivitas antidiabetes, sedangkan kontrol positif tablet akarbose terbukti memiliki aktivitias antidiabetes yang besar. Tetapi tidak menjamin bahwa kontrol positif tablet akarbose juga memiliki senyawa yang murni.
Analisis Fraksi 1.2 dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif