1992)
Sebanyak 1 g sampel yang telah bebas lemak dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian, ditambahkan 25 ml buffer natrium fosfat 0.1 M pH 6.0 dan disuspensikan.Termamyl sebanyak 100µl ditambahkan. Erlenmeyer ditutup dan diinkubasikan pada penangas air mendidih selama 15 menit dan sekali-kali diaduk. Setelah itu, diangkat dan didinginkan. Sebanyak 20 ml air destilata ditambahkan dan pHnya diatur dengan HCl sampai pH 1.5. Kemudian, sebanyak 100 mg pepsin ditambahkan. Erlenmeyer diinkubasikan kembali pada suhu 40oC dan diagitasi selama 60 menit. Setelah itu, sebanyak 20 ml air destilata ditambahkan kembali dan pHnya diatur menjadi pH 6.8 dengan NaOH. Sebanyak 100 mg pankreatin lalu ditambahkan. Kemudian erlenmeyer diinkubasi pada suhu 40oC dan diagitasi selama 60 menit. Setelah itu, pHnya diatur kembali menjadi 4.5 dengan penambahan HCl. Saring melalui kertas saring kering (berat tepat diketahui). Lalu, cuci dengan 2 x 10 ml air destilata.
Residu (serat pangan tidak larut/Insoluble dietary fiber (IDF))
Setelah kertas saring dicuci dengan air destilata, dilanjutkan dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton. Kertas saring dikeringkan pada suhu 105oC sampai berat tetap (sekitar 12 jam). Kemudian, ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D1). Kertas saring lalu diabukan dalam tanur 150oC selama paling sedikit 5 jam. Kemudian ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I1).
Filtrat (serat pangan larut/Soluble dietary fiber (SDF))
Filtrat yang diperoleh pada penyaringan pertama dan setelah dicuci air destilata, diatur volumenya hingga 100 ml. Kemudian etanol 95% hangat (60oC) sebanyak 400 ml ditambahkan. Setelah itu, disaring dengan menggunakan kertas saring kering yang telah diketahui beratnya. Residu dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 78%, 2 x 10 ml etanol 95%, dan 2 x 10 ml aseton. Kemudian, ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D2). Kertas saring lalu diabukan dalam tanur 150oC selama paling sedikit 5 jam. Kemudian ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I2).
Blanko
Blanko untuk serat pangan tidak larut dan larut diperoleh dengan cara yang sama, tetapi tanpa sampel (B1 dan B2).
Perhitungan: %IDF = D1-I1-B1 x 100 W %SDF = D2-I2-B2 x 100 W W : Bobot sampel (g)
Analisis Asam Nukleat
Analisis asam nukleat dilakukan dengan menggunakan Nanodrop spektrofotometer 2000 dan panjang gelombang 260 dan 280 nm. Sebanyak 0.5 g sampel yang telah dihaluskan, ditambahkan 600 µl CTAB yang sebelumnya telah diinkubasi pada suhu 65oC. Campuran ditambahkan N2 cair dan dihaluskan, kemudian ditempatkan ke dalam eppendorf yang di dalamnya terdapat CTAB. Setelah itu, tabung eppendorf dibolak-balikkan untuk mencampurkan, lalu diinkubasi pada suhu 65oC selama 30 menit, dilanjutkan inkubasi pada suhu rendah selama 5 menit. Kemudian, ditambah CI (24:1) dan dilakukan pencampuran. Setelah itu, campuran disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm suhu 4oC selama 10 menit. Sebanyak 600 µl supernatan diambil dan ditambahkan 600 µl PCI (25:24:1). Kemudian dilakukan pencampuran dan disentrifus kembali dengan kecepatan 10000 rpm suhu 4oC selama 5 menit. Apabila supernatan masih keruh, campuran ditambahkan PCI dan disentrifus kembali. Apabila supernatan sudah jernih, supernatan tersebut ditempatkan pada eppendorf steril. Setelah itu, ditambahkan 0.1 x vol. supernatan larutan NaOAC 2 M pH 5.2 dan 2 x vol supernatan EtOH 100%. Campuran ditempatkan dalam freezer selama lebih kurang 30 menit. Kemudian, dilakukan dua kali sentrifus dengan kecepatan 10000 rpm suhu 4oC selama 15 menit. Pelet yang terbentuk ditambah EtOH 70%, lalu disentrifus kembali dengan kecepatan 10000 rpm suhu 4oC selama 10 menit. Pelet divakum lalu dikeringkan 30oC. Kemudian ditambahkan DNase, RNase, dan 50 µl ddH2O. Campuran diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit dilanjutkan 70oC selama 10 menit. Setelah itu, sebanyak 1 µl sampel diukur total asam nukleatnya dengan nanodrop spektrofotometer.
Analisis Asam Amino
Prosedur analisis (AOAC 1995) yang dilakukan adalah sebagai berikut: sebanyak 0.15 g sampel dimasukkan ke dalam tabung 25 ml dan ditambahkan 10 ml HCl 6 N. Sampel dipanaskan selama 24 jam pada suhu 110°C dan disaring. Hasil saringan diambil sebanyak 30 ml dan ditambahkan dengan larutan pengering metanol, pikolotiosianat, dan trietilamin dengan perbandingan 2:2:1 dan dilakukan penambahan gas N2. Kemudian sampel ditambahkan dengan larutan derivatisasi dari campuran metanol, natrium asetat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Selanjutnya, sampel yang sudah kering dilarutkan dengan 10 ml buffer natrium asetat 1 M, lalu dibiarkan selama 20 menit. Kolom HPLC yang digunakan ialah kolom pico tag 3.9 x 150 mm dengan fase gerak asetonitril 60% dan buffer natrium asetat 1 M. Detektor yang digunakan ialah UV dengan panjang gelombang 254 nm. Penentuan kadar asam amino ditentukan dengan rumus berikut:
Kadar asam amino= A
B x C
D x BM x FP x 100
Keterangan:
A = Luas area sampel B = Luas area standar C = Konsentrasi standar
D = Bobot sampel awal µg
BM = Bobot molekul masing-masing asam amino FP = Faktor pengenceran
Analisis yang dilakukan terhadap formula daging analog yang dihasilkan:
Analisis Karakteristik Fisik
Analisis karakteristik fisik terhadap produk daging analog yang dilakukan adalah analisis profil teksturnya (TPA) dengan menggunakan textur analyzer.
Pengujian yang dilakukan meliputi tiga parameter yakni kekerasan (hardness), elastisitas (springiness), dan daya kunyah (chewiness). Kondisi analisis (Min dan Lee 2004 yang dimodifikasi) yang digunakan adalah:
Probe : silinder 3.5 cm (SMS P/35) Mode : texture Profile Analysis Option : return to start
Pretest speed : 5 mm/s Test speed : 0.5 mm/s Posttest speed : 5 mm/s
Distance : 30%
Trigger type : auto Trigger force : 5 g
Penentuan ketiga parameter dilakukan dengan cara:
Kekerasan : maksimal gaya (nilai puncak) pada tekanan pertama.
elastisitas : jarak yang ditempuh oleh sampel pada tekanan kedua sehingga tercapai nilai gaya maksimal (L2) dibandingkan dengan jarak yang ditempuh sampel pada tekanan pertama sehingga tercapai nilai gaya maksimalnya (L1) dan dirumuskan L2/L1.
Daya kunyah : hasil perkalian elastisitas dengan perbandingan antara luasan area di bawah kurva hasil pengukuran pada tekanan kedua (A2) dan tekanan pertama (A1).
Analisis yang dilakukan terhadap formula daging analog terpilih:
Analisis Proksimat
Rincian dan metode analisis telah dijelaskan sebelumnya.
Analisis Asam Amino
Rincian dan metode analisis telah dijelaskan sebelumnya.
Analisis Komposisi Asam Lemak
Komposisi asam lemak (AOAC 991.39) dilakukan dengan memasukkan sebanyak 100 mg sampel. Kemudian, sampel ditambahkan 1 ml larutan standar internal (SI) (asam lemak margarat/C17:0) dan 1.5 ml NaOH metanolik 0.5 N. Tabung diisi dengan N2 lalu ditutup rapat dan divortex. Tabung dipanaskan dalam penangas bersuhu 80-100oC selama 5 menit. Setelah itu, didinginkan. Kemudian, sebanyak 2 ml BF3 metanol (14% b/v) ditambahkan ke dalam tabung, lalu tabung diisi dengan N2 dan ditutup rapat. Tabung dipanaskan kembali dalam penangas bersuhu 80-100oC selama 30 menit selanjutnya didinginkan hingga mencapai suhu ruang. Sebanyak 1 ml heksana ditambahkan ke dalam tabung dan divortex, kemudian ke dalam tabung juga ditambahkan 3 ml larutan NaCl jenuh dengan segera lalu dikocok. Lapisan heksana dipisahkan dan ditambah Na2SO4 anhidrous. Kemudian, dilakukan penyuntikkan ke dalam alat GLC (Gas Liquid Chromatography) dengan suhu injektor 250oC dan suhu detektor 260oC. Suhu kolom diatur secara gradien dengan suhu awal 120oC dipertahankan selama 6
menit, peningkatan suhu kolom 3oC/menit hingga mencapai suhu 230oC dan dipertahankan selama 25 menit. Tekanan gas helium diatur pada 1 kg/cm2, tekanan gas hidrogen dan udara masing - masing 0.5 kg/cm2. Asam lemak standar digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi asam lemak sampel.
Perhitungan jumlah asam lemak (%bb) dilakukan dengan menggunakan perumusan:
Kadar asam lemak = A
B x RF x
mg SI
berat sampel awal (mg) x 100
Keterangan:
A = Area asam lemak A B = Area standar internal (SI)
Nilai RF (Respond Factor) setiap asam lemak dihitung dari kromatogram standar eksternal FAME dengan menggunakan perumusan:
RFA = area SI [SI] x
[asam lemak A dari standar] area asam lemak A dari standar
Analisis Total Fenol dan Kapasitas Antioksidan Persiapan Sampel Analisis Kapasitas Antioksidan
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut dan metode yang digunakan Chirinang dan Intarapichet (2009). Sebanyak 10 g sampel dalam bentuk kering diekstrak dengan menggunakan 100 ml etanol 95% atau air. Campuran tersebut dishaker dengan kecepatan 150 rpm selama 24 jam, kemudian disaring dengan kertas Whatman No. 4. Residu dicuci dengan pelarut sebanyak 2 kali, kemudian filtrat digabungkan dengan hasil saringan sebelumnya. Filtrat ini diuapkan dengan menggunakan rotavapor pada suhu 40oC hingga hampir kering. Ekstrak dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer. Kemudian, hasil freeze dryer dilarutkan dengan pelarut hingga diperoleh konsentrasi larutan 20 mg/ml. Larutan stok ini disimpan pada suhu 4oC untuk analisis kapasitas antioksidan.
Analisis Kapasitas Antioksidan
Metode analisis kapasitas antioksidan yang digunakan adalah DPPH seperi yang digunakan oleh Hung dan NHI (2012). Sebanyak 0.1 ml larutan ekstrak dicampurkan dengan 3.9 ml larutan DPPH 0.075 mM. Campuran ditempatkan dalam ruangan gelap selama 30 menit. Kemudian, diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV 525 nm. Sebanyak 0.1 ml metanol digunakan sebagai pengganti sampel untuk blanko. Blanko diukur pada t=0. % DPPH dihitung dengan menggunakan perumusan:
% = −
Analisis Total Fenol
Analisis ini dilakukan karena jamur yang digunakan mengandung komponen fenolik yang berpotensi memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Prosedur analisis (Chirinang dan Intarapichet 2009) adalah sebagai berikut: sebanyak 100 µl larutan sampel ditambahkan 2 ml natrium karbonat 2%, dicampurkan selama 2 menit. Kemudian sebanyak 100 µl reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan ke dalam campuran, dan didiamkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Absorbansi diukur pada 750 nm. Penetapan konsentrasi dilakukan dengan menggunakan asam galat,
sehingga konsentrasi senyawa fenol yang dihasilkan memiliki satuan mg AGE (Asam Galat Ekuivalen)/g.
Analisis Statistika
Data dianalisis dengan menggunakan uji ragam atau Analysis of Variance
(ANOVA) dan uji lanjut Duncan. Analisis dilakukan dengan taraf signifikansi 0.05. Pengolahan data dilakukan menggunakan aplikasi SPSS ver. 16 (Chicago, USA).