1) Cawan dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC-110oC selama 1 jam dan kemudian dimasukkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (X1).
2) Bahan ditimbang 2-3 g (A).
3) Cawan dan bahan dipanaskan dalam tanur pada suhu 600oC sampai menjadi abu kemudian dimasukkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (X2).
Kadar abu (%) = X2− X1 A x 100 Kadar Serat Kasar
1) Kertas saring dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 105oC-110oC
setelah itu didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang (X1).
2) Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g (A) lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL.
3) H2SO4 0,3 N sebanyak 50 mL ditambahkan ke dalam erlenmeyer lalu
dipanaskan di atas pembakar bunsen selama 30 menit. Setelah itu NaOH 1,5 N sebanyak 25 mL ditambahkan ke dalam erlenmeyer dan dipanaskan kembali selama 30 menit.
4) Larutan dan bahan yang telah dipanaskan kemudian disaring dalam corong Buchner dan dihubungkan pada vacuum pump untuk mempercepat filtrasi. 5) Larutan dan bahan yang ada pada corong Buchner kemudian dibilas secara
berturut-turut dengan 50 mL air panas, 50 mL H2SO4 0,3 N, 50 mL air panas
dan 25 mL aseton.
6) Kertas saring dan isinya lalu dimasukkan ke dalam cawan porselin dan kemudian dipanaskan dalam oven 105-110oC selama 1 jam kemudian didinginkan dalam desikator 5-15 menit dan ditimbang (X2).
7) Setelah itu dipanaskan dalam tanur 600oC hingga berwarna putih atau abu-
20
15 menit, didinginkan dalam desikator selama 5-15 menit dan ditimbang (X3).
Kadar serat kasar = X2− X1−X3 A x 100
Kadar Protein - Tahap oksidasi
1) Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl. 2) Katalis (K2SO4+CuSO4.5H2O) dengan rasio 9:1 ditimbang sebanyak 3 g
dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl.
3) Sebanyak 10 mL H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam labu Kjeldahl dan
kemudian labu tersebut dipanaskan dalam rak oksidasi pada suhu 400oC selama 3-4 jam sampai terjadi perubahan warna cairan dalam labu menjadi hijau bening.
4) Larutan didinginkan lalu ditambah 100 mL air destilasi. Kemudian larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan akuades sampai volume larutan mencapai 100 mL. Larutan sampel siap untuk didestilasi. - Tahap destilasi
1) Beberapa tetes H2SO4 dimasukkan ke dalam labu, sebelumnya labu diisi
setengahnya dengan Aquades untuk menghindari kontaminasi oleh ammonia lingkungan. Kemudian didihkan selama 10 menit
2) Erlenmeyer diisi 10 mL H2SO4 0.05 N dan ditambahkan 2 tetes indicator
methyl red diletakkan di bawah pipa pembuangan kondensor dengan cara dimiringkan sehingga ujung pipa tenggelam dalam cairan.
3) Sebanyak 5 mL larutan sampel dimasukkan ke dalam tabung destilasi melalui corong yang kemudian dibilas dengan aquades dan ditambahkan 10 mL NaOH 30% lalu dimasukkan melalui corong tersebut dan ditutup. 4) Campuran alkalin dalam labu destilasi disuling menjadi uap air selama 10
menit hingga terjadi pengembunan pada kondensor.
5) Labu erlenmeyer diturunkan hingga ujung pipa kondensor berada di leher labu pada permukaan larutan. Kondensor dibilas dengan aquades selama 1-2 menit.
- Tahap Titrasi
1) Larutan hasil destilasi dititrasi dengan larutan NaOH 0,05 N. 2) Volume hasil titrasi lalu dicatat.
3) Prosedur yang sama juga dilakukan pada blanko Kadar protein = . ∗x − x , ∗∗x x Keterangan:
Vb = volume hasil titrasi blanko (mL) Vs = volume hasil titrasi sampel (mL) S = bobot sampel (g)
* = 1 mL 0,05 NaOh ekuivalen dengan 0,0007 g nitrogen ** = faktor nitrogen
21 Kadar Lemak
- Metode ekstraksi Soxhlet
1) Labu ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC-110oC dalam waktu 1 jam. Kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan bobot labu ditimbang (X1).
2) Sampel ditimbang sebanyak 3-5 g (A), dan dimasukkan ke dalam selongsong tabung filter dan dimasukkan ke dalam soxhlet dan diletakkan pemberat di atasnya.
3) N-hexan 100-150 mL dimasukkan ke dalam soxhlet hingga selongsong terendam dan sisa N-hexan dimasukkan ke dalam labu.
4) Labu yang telah dihubungkan dengan soxhlet dipanaskan di atas water bath
hingga cairan yang merendam sampel di dalam soxhlet berwarna bening. 5) Labu lalu dilepaskan dan tetap dipanaskan hingga N-hexan menguap. 6) Labu dan lemak yang tersisa dipanaskan dalam oven selama 15-60 menit,
kemudian didinginkan dalam desikator selama 15-30 menit dan ditimbang (X2).
- Metode Folch
1) Labu silinder dioven terlebih dahulu pada suhu 105oC-110oC selama 1 jam, lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang (X1).
2) Sampel ditimbang sebanyak 2-3 g (A) dan dimasukkan ke dalam gelas homogen dan ditambahkan larutan kloroform/methanol (20 x A), sebagian disisakan untuk membilas pada saat penyaringan.
3) Sampel dihomogenkan selama 5 menit lalu disaring dengan vacuum pump. 4) Sampel yang telah disaring tersebut dimasukkan ke dalam labu pemisah yang telah diberi larutan MgCI2 0,03 N (0,2 x C) lalu dikocok dengan kuat
minimal selama 1 menit kemudian ditutup dengan aluminium foil dan didiamkan selama 1 malam.
5) Lapisan bawah yang terdapat dalam labu pemisah disaring ke dalam labu silinder kemudian dievaporator sampai kering. Sisa kloroform/methanol yang terdapat dalam labu ditiup dengan menggunakan vacuum lalu ditimbang (X2).
Kadar lemak (%) = X2− X1 A x 100
22
Lampiran 2. Prosedur analisis asam amino esensial (AOAC 1999) Prosedur kerja
- Sampel ditimbang 0,25-0,5 g
- Sampel dimasukan ke dalam tabung 25 mL - Ditambahkan HCL 6 N 5-10 mL
- Dipanaskan semala 24 jam pada suhu 1000C - Disaring
- Diambil 30 µL sampel dan ditambahkan larutan pengering* - Dikeringkan/ divakumkan
- Ditambahkan 30 µL larutan derivatisasi* - Diamkan selama 20 menit
- Ditambahkan 2 mL natrium acetat 1 M - Injek ke alat (HPLC)
Keterangan :
Larutan pengering : methanol, picolotiocianat, triethylamine Larutan derivatisasi : methanol, Na-acetat, triethylamine Kondisi alat
Temperatur : suhu ruang
Kolom : pico tag 3,9x150 nm
Kecepatan alir : 1,5 mL/menit Batas tekanan : 3000 psi
Program : gradien
Fase gerak : aseronitril 60%
Buffer natrium acetat 1 M
Detektor : UV Panjang gelombang : 254 nm Perhitungan: � % = ℎ × � × � × � × Keterangan: BM = berat molekul
Asam amino Berat molekul
Arginin Histidin Threonin Alanin Methionin Isoleusin Leusin Phenilalanin Lisin 174,2 155,1 119,1 89,0 149,2 131,1 131,4 165,1 146,1
23 Lampiran 3. Prosedur pengamatan gambaran darah
1. Pengambilan sampel darah ikan
Pertama-tama syringe dibilas dengan menggunakan anti koagulan (Na-Sitrat 3.8%). Kemudian sampel darah ikan diambil dari pembuluh vena dekat caudal yaitu pembuluh di dekat ekor. Penyuntikan dilakukan di daerah caudal (di bawah vertebrae) dengan arah menuju cranial. Darah diambil secara perlahan, kemudian darah yang telah diambil dengan syringe ditampung dalam eppendorf.
2. Pengukuran hemoglobin (Hb) (Collier 1944)
Darah ikan dalam eppendorf diambil dengan menggunakan pipet Sahli sampai 20 mm3/0.2 ml. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung Hb-meter, kemudian
tambahkan HCl 0.1 N dan diamkan selama 1 menit. Selanjutnya tambahkan akuades pada Hb-meter secara perlahan hingga warnanya sama dengan kedua larutan (indikator) yang terdapat di samping tabung Hb-meter. Kadar hemoglobin ditunjukan dengan skala yang terbaca (gr per 100 ml darah).
3. Pengukuran hematokrit (Anderson & Siwicki 1993)
Darah dihisap dengan menggunakan tabung mikrohematokrit hingga ¾ bagian tabungnya, kemudian ujung tabung ditutup dengan cara ditancapkan ke crytoceal. Darah dalam mikrohematokrit disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Banyaknya sel darah ditunjukan oleh persentase panjang endapan dengan panjang totalnya. Rumus perhitungan kadar hematokrit yang digunakan adalah:
Hk = �x 100%
Keterangan
a: Panjang endapan
b: Panjang total volume darah
4. Pengamatan sel darah merah (Blaxhall & Daisley 1973)
Darah ikan diambil pada tiap perlakuan. Darah dihisap menggunakan pipet hemositometer berbulir merah sampai skala 0.5 lalu diencerkan dengan larutan Hayem sampai skala maksimum 10.1. Kedua ujung ditutup sejajar kemudian digoyangkan membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Selanjutnya, larutan pada bagian ujung pipet yang tidak teraduk dibuang sebanyak 1 tetes. Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam hemositometer yang telah dilengkapi dengan kaca penutup. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah eritrosit dihitung pada 5 kotak besar hemositometer dengan faktor pengenceran 200 kali. Berikut ini adalah rumus perhitungan total eritrosit:
�� 5 = 5 × 5 × × �� /
Keterangan :
N : jumlah sel darah yang teramati
FP : untuk darah yang dihisap hingga skala 1 = 100 untuk darah yang dihisap hingga skala 0,5 = 200
24
5. Pengamatan sel darah putih (Blaxhall & Daisley 1973)
Darah ikan diambil dari masing-masing perlakuan. Darah dihisap menggunakan pipet hemasitometer berbulir putih sampai skala 0.5 lalu diencerkan
dengan larutan Turk’s sampai skala maksimum 11. Kedua ujung ditutup sejajar
kemudian digoyangkan membentuk angka delapan selama 3-5 menit. Setelah itu, larutan pada bagian ujung pipet yang tidak teraduk dibuang sebanyak 1 tetes. Tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam hemasitometer yang telah dilengkapi dengan kaca penutup. Perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x dan jumlah leukosit dihitung pada 5 kotak besar hemasitometer dengan faktor pengenceran 20 kali. Berikut ini adalah rumus perhitungan total leukosit:
��� 5 = 5 × 5 × × �� /
Keterangan
N : jumlah sel darah yang teramati
FP : untuk darah yang dihisap hingga skala 1 = 10 untuk darah yang dihisap hingga skala 0,5 = 20
25 Lampiran 4. Prosedur Analisis Asam Sianida (HCN)
Sianida dalam sampel diubah menjadi sianogen chloride (CNCl) karena bereaksi dengan chloramin T pada pH kurang dari 8 terhidrolisa menjadi sianat. Setelah bereaksi secara sempurna, CNCl membentuk warna merah biru dengan asam barbiturat dalam piridin dan warna yang terjadi dibaca pada λ 578 nm.
Alat dan Bahan
- Timbangan analitik - Sentrifuge
- Pipet Otomatis - Tabung reaksi - Rak tabung reaksi - Vortex - Spektrofotometer - NaH2PO4.H2O - Chloramin T - Pyridin - HCl 37% - Standar KCN Reagen/Pereaksi :
1) Buffer CN ( 138 gram NaH2PO4.H2O dilarutkan menjadi 1 liter aquadest)
2) Chloramin T 1% ( 1 gram dilarutkan menjadi 100 ml aquadest)
3) Asam Barbiturat – Pyridin ( 3 gram asam barbiturat ditambah 15 ml pyridin dan 3 ml HCl 37%, ditambahkan aquadest hingga volumenya 50 ml) Prosedur Kerja :
1) Sampel sebanyak ± 1 gram , dilarutkan dengan aquadest sebanyak 10 ml, ditutup dan didiamkan semalam.
2) Sampel disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm.
3) Supernatan sampel dipipet sebanyak 0.1 ml, lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan aquadest sebanyak 1.9 ml.
4) Dimasukkan kedalamnya 2 ml larutan buffer CN dan 0.5 ml Chloramin T 1%.
5) Divortex/dihomogenkan dan didiamkan selama 2 menit. Setelah itu ditambahkan 0.5 ml larutan asam barbiturat-pyridin, kemudian dihomogenkan kembali.
6) Dibuat deret standar dari larutan standar KCN 10 ppm, dengan deret 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 ppm.Dan dilakukan prosedur yang sama dengan sampel, yaitu tahap 3 sampai tahap 5.
7) Lalu larutan sampel dan standar siap diukur pada spektrofotometer dengan λ 578 nm.
26
