BAB II KAJIAN PUSTAKA
D. Uji in vivo
In vivo berasal dari bahasa latin (within the living) adalah eksperimen dengan menggunakan keseluruhan organisme hidup. Pengujian dengan hewan uji maupun uji klinis merupakan bentuk penelitian in vivo. Pada penelitian ini uji in vivo dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian senyawa Cr(III)nitrat terhadap kadar glukosa darah hewan uji yang menderita diabetes mellitus tipe 2. Pemilihan hewan uji pada penelitian didasarkan pada patogenesis penyakit tersebut pada manusia yang bersifat kronis atau akut.
Hewan uji yang dapat dibuat secara patologis menderita diabetes mellitus antara lain mencit, tikus, kelinci atau anjing. Meskipun demikian, keadaan patologis
25
pada hewan uji tersebut tidak menggambarkan patologi secara riil pada manusia. Pada penelitian ini menggunakan hewan uji tikus Wistar jantan.
1. Hewan uji
Hewan uji atau sering disebut hewan laboratorium adalah hewan yang khusus diternakkan untuk keperluan penelitian biologik. Hewan laboratorium tersebut digunakan sebagai model untuk penelitian pengaruh bahan kimia atau obat pada manusia. Beberapa jenis hewan dari yang ukurannya terkecil dan sederhana ke ukuran yang besar dan lebih komplek digunakan untuk keperluan penelitian adalah mencit, tikus, kelinci, dan kera (Kusumawati, 2004).
Penelitian ini menggunakan tikus putih jantan galur Wistar (gambar 12) yang merupakan keturunan dari tikus albino yang termasuk dalam spesies Rattus novergicus. Tikus wistar merupakan hewan yang sering digunakan untuk penelitian karena adanya kemiripan sistem metabolisme dengan manusia (Nugroho, 2006). Berat badan tikus Wistar jantan sekitar 200-400 g dan waktu hidup 2,5 sampai dengan 3 tahun merupakan salah satu pertimbangan pemilihan hewan uji diabetes mellitus. Kondisi biologi tikus putih jantan galus Wistar dapat dilihat pada tabel 4.
26 Klasifikasi tikus putih galur wistar Kingdom : Animalia
Kelas : Mamalia Orde : Rodentia Famili : Muridae Genus : Rattus
Species : Rattus norvegicus
Tabel 4. Data Biologik Tikus
Kondisi Biologi Jumlah
Konsumsi makan per hari 5 g/100 g bb
Konsumsi air minum per hari 8-11 mL/100 g bb
Diet protein 12%
Ekskresi urin per hari 5,5 mL/100 g bb
Lama hidup 2,5-3 tahun
Bobot badan dewasa - Jantan
- Betina 300-400 g 250-300 g
Bobot lahir 5-6 g
Umur sapih 21 hari, 40-50 g
Mulai makan pakan kering 12 hari
Rasio kawin 1 jantan – 3 atau 4 betina
Suhu rektal 37,5ºC
Laju respirasi 85 x/mn
Denyut jantung 300 – 500 x/mn
Pengambilan darah maksimum 5,5 mL/kg
Jumlah sel darah merah 7,2-9,6 x 106/μL
Kadar haemoglobin (Hb) 15,6 g/dl
Kondisi hiperglikemia pada hewan uji pertama kali dilakukan dengan cara pengambilan seluruh atau sebagian pankreas (pankreatomi), namun dengan metode tersebut tidak mencerminkan kondisi patologis pada manusia. Metode tanpa pembedahan dilakukan dengan pemberian diabetogenik yaitu zat toksin yang dapat
27
merusak pankreas. Kerusakan tersebut dapat menghasilkan beberapa kondisi komplikasi seperti pada manusia (Nugroho, 2006).
2. Zat Penginduksi Diabetes Mellitus
Terdapat beberapa zat toksin yang dapat digunakan untuk membuat hewan uji menderita diabetes mellitus tipe 2 diantaranya adalah aloxan dan streptozotocin. Dalam penelitian ini streptozotocin dipilih sebagai zat penginduksi diabetes. Streptozotocin (STZ) atau 2-deoksi-2-[3-(metil-3-nitrosoureido)-D-gluko piranosa] diperoleh dari Streptomyces achromogenes dapat digunakan untuk menginduksi kedua tipe diabetes mellitus. Streptozotocin merupakan turunan dari glukosa dengan struktur kimia yang terdapat dalam gambar 13.
Gambar 13. Struktur Streptozotocin (MSDS Streptozotocin)
Streptozotocin mempunyai aktivitas anti-neoplasma dan antibiotik spektrum luas yang secara langsung dapat merusak masa kritis sel β-Langerhans atau proses autoimun sel β sehingga menyebabkan keadaan diabetes pada hewan uji yang ditandai dengan poliuria dan hiperglikemia (Szkudelski, 2001; Eleazu et al., 2013). Streptozotocin menembus sel β Langerhans melalui transporter glukosa GLUT 2. Aksi streptozotocin intraseluler menghasilkan perubahan DNA sel β pankreas. Alkilasi oleh streptozotocin melalui gugus nitrosourea menghasilkan kerusakan
28
pada sel β. Streptozotocin merupakan donor NO (nitric oxide) yang mempunyai kontribusi terhadap kerusakan sel tersebut melalui peningkatan aktivitas guanilil siklase dan pembentukan cGMP. Nitric Oxide dihasilkan pada saat streptozotocin mengalami metabolisme dalam sel. Dalam hal ini streptozotocin menghambat siklus Krebs dan menurunkan konsumsi oksigen mitokondria. Produksi ATP mitokondria yang terbatas selanjutnya mengakibatkan pengurangan secara drastis nukleotida sel β pankreas (Szkudelski, 2001). Skema mekanisme perusakan sel β pankreas akibat paparan streptozotocin dapat dilihat pada gambar 14.
Gambar 14. Mekanisme Kerusakan Sel β akibat Paparan Streptozotocin Induksi streptozotocin dapat menghasilkan diabetes tipe I dan II yang akan membedakan adalah jumlah sel β pankreas yang rusak (Sharma, 2010). Pada diabetes tipe I terjadi defisiensi insulin serta jumlah sel β pankreas yang rusak 70-80% dan pada diabetes mellitus tipe 2 terjadi kurang pekanya reseptor insulin dan juga mengalami kerusakan sel β 25-50% (Cnop, 2005). Hewan uji diinduksi secara intravena atau intraperitonial dengan dosis 100 mg/kg bb pada tikus.
29
Agar tidak terjadi kerusakan yang parah pada sel β pankreas dan menyebabkan hewan uji mati, streptozotocin dikombinasikan dengan senyawa nicotinamide nama lainnya adalah vitamin B3. Nicotinamide merupakan amida dari asam nicotinat (vitamin B3/niacin) yang terlarut dalam air. Nicotinamide mempunyai struktur seperti pada gambar 15.
Gambar 15. Struktur Nicotinamide
Penelitian yang dilakukan oleh Ibrahim dan Sherine (2008) menunjukkan bahwa nicotinamide yang diberikan secara intraperitonial pada tikus Wistar dengan dosis 100 mg/kg bb mampu mengurangi glukosa dalam darah. Dengan kata lain, insulin yang dihasilkan pankreas lebih banyak. Kerusakan pankreas dapat dipulihkan oleh nicotinamide.
3. Pengukuran Kadar Glukosa Darah (KGD)
Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan sebagai parameter sebelum dan sesudah induksi diabetes. Pengukuran kadar glukosa darah dapat diukur melalui 2 macam teknik, yaitu secara kimiawi dan enzimatik. Pada cara-cara kimia memanfaatkan sifat mereduksi molekul glukosa yang tidak spesifik sedangkan pada cara enzimatik, glukosa oksidase bereaksi dengan membebaskan hidrogen peroksida yang banyaknya diukur secara tak langsung. Kadar glukosa darah dengan
30
pemeriksaan secara reduksi memiliki nilai yang lebih tinggi 5-15mg/dL dibandingkan dengan cara enzimatik (Frances, 1989).
Metode-metode pemeriksaan KGD secara kimia meliputi metode Folin, Samogyl-Nelson, Orto-tholuidin, Glukosa oksidase/peroksidase. Metode yang dipilih untuk pemeriksaan KGD pada penelitian ini adalah metode glukosa oksidase/peroksidase yaitu metode GOD-PAP. Metode GOD-PAP merupakan reaksi kolorimetri enzimatik untuk pengukuran pada daerah visible yaitu pada panjang gelombang sekitar 546 nm. Prinsip dalam metode GOD-PAP adalah glukosa oksidase (GOD) mengkatalisasi oksidasi dari glukosa, sesuai persamaan berikut :
Glukosa + O2 + H2O asam glutamat + H2O2
Hidrogen peroksida yang terbentuk dari reaksi ini bereaksi dengan 4-aminoantipyrin (4-Hidroxybenzoic acid). Dengan adanya peroksidase (POD) dan membentuk N-(4-antipyril)-P-benzoquinone imine. Konsentrasi glukosa sebanding dengan zat warna yang terbentuk. Pengukuran konsetrasi glukosa dilakukan dengan spektrometer.