4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.5 Karakterisasi Isolat Bakteri
Gambar 9 Pertumbuhan isolat m2, m5, dan m6 pada media APW modifikasi.
4.5 Karakterisasi Isolat Bakteri
Karakterisasi dilakukan untuk mengetahui karakteristik tiap bakteri yang merupakan data awal menuju identifikasi hingga tingkat spesies. Untuk melihat karakteristik dari isolat bakteri yang ada, dilakukan beberapa tahapan uji yang meliputi uji morfologi koloni dan uji morfologi sel. Uji morfologi koloni pada isolat bakteri dari anoda SMFC terdiri dari bentuk atas, bentuk tepian, bentuk elevasi, warna koloni, dan ukuran, sedangkan uji morfologi sel terdiri dari bentuk sel, pewarnaan Gram, endospora, dan motilitas. Hasil karakterisasi isolat bakteri menunjukkan bahwa isolat m2 merupakan bakteri motil Gram negatif batang, isolat m5 merupakan bakteri tidak motil Gram negatif kokus, dan isolat m6 merupakan bakteri motil Gram positif batang dengan endospora (Tabel 3).
Tabel 3 Bentuk morfologi koloni dan sel isolat m2, m5, dan m6
Sifat Isolat m2 m5 m6
Morfologi Koloni
Bentuk atas Membulat seperti titik Membulat
Bentuk tepian Halus Halus Halus
Bentuk elevasi Timbul Timbul Timbul
Warna koloni Kuning Putih Putih
Ukuran 1-2 mm 1-2 mm >2 mm
Morfologi Sel
Bentuk sel Batang Kokus Batang
Gram Negatif Negatif Positif
Endospora (-) (-) (+)
Motilitas (+) (-) (+)
Keterangan: (+) menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki sifat tersebut di atas (-) menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak memiliki sifat tersebut di atas
0,5 cm 0,5 cm
32 Hasil pewarnaan Gram bakteri memperlihatkan memperlihatkan jumlah kandungan lipid pada dinding sel bakteri. Isolat bakteri Gram negatif, isolat m2 dan m5, memiliki kandungan lipid yang lebih tinggi dibandingkan isolat bakteri Gram positif, isolat m6 (Gambar 10). Kandungan lipid yang rendah pada dinding sel bakteri mengakibatkan sel lebih mudah terdehidrasi akibat perlakuan dengan alkohol. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan ukuran pori-pori sel menjadi kecil dan daya permeabilitasnya berkurang sehingga zat warna ungu kristal yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel sehingga sel akan tetap bewarna ungu. Sedangkan isolat m2 dan m5 terlihat bewarna merah karena bakteri ini kehilangan pewarna kristal violet pada waktu pembilasan dengan alkohol namun menyerap pewarna tandingan, yaitu safranin. Selain itu lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif juga lebih tipis daripada peptidoglikan bakteri Gram positif (Pelczar & Chan 2005).
(a) (b) (c)
Gambar 10 Bentuk sel dan hasil pewarnaan Gram isolat: (a) m2, (b) m5, dan (c) m6 pada perbesaran mikroskop 1000 x.
Isolat m6 menunjukkan adanya pembentukan endospora yang terletak pada ujung sel yang dapat dilihat pada uji pewarnaan endospora (Gambar 11). Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa isolat m6 memiliki endospora yang ditunjukkan adanya warna hijau berbentuk bulat. Jika terdapat warna hijau diluar sel, hal tersebut menandakan endospora tersebut telah keluar dari sel yang pecah dalam usaha menggandakan diri.
Endospora bersifat tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi sulit untuk melepaskan zat warna yang telah terserap kedalamnya, sehingga digunakan pemanasan untuk membantu proses penyerapan. Namun endospora tidak dapat mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya (counterstrain). Letak endospora di dalam sel dan ukurannya tidaklah sama bagi semua spesies. Oleh
karena itu, adanya letak, dan ukuran endospora sangat bermanfaat di dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Harley & Prescott 2002).
Gambar 11 Pewarnaan endospora pada isolat m6 pada perbesaran mikroskop 1000 x.
Pada pengujian motilitas bakteri, hasil yang didapat menunjukan bahwa kedua isolat, yaitu isolat m2 dan m6 bersifat motil sedangkan isolat m5 bersifat nonmotil. Sifat motilitas dilihat dengan menggunakan preparat lekupan basah yang diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran 1000 x.
Isolat motil menunjukkan bahwa bakteri tersebut mempunyai flagela sebagai organ untuk bergerak. Flagela adalah salah satu struktur utama di luar sel bakteri yang menyebabkan terjadinya pergerakan (motilitas) pada sel bakteri. Flagela terbuat dari subunit-subunit protein yang disebut flagelin. Bacillus dan Spirilum merupakan sebagian besar spesies bakteri yang memiliki flagela sebagi alat geraknya, tetapi jarang ditemukan pada bakteri yang berbentuk kokus. Pola pelekatan flagela pada bakteri digunakan untuk mengklasifikasi bakteri ke dalam kelompok taksonomi tertentu (Pelczar & Chan 2005).
Uji katalase bertujuan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada isolat bakteri. Katalase adalah enzim yang mampu mengkatalisasi proses penguraian
hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik
terhadap sel sehingga bahan ini dapat mengaktivasi enzim dalam sel. Uji tersebut penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap kebutuhan akan oksigen. Bakteri dapat dibagi menjadi tiga grup berdasarkan kebutuhan akan oksigen, yaitu bakteri yang bersifat aerobik, anaerobik, dan anaerobik fakultatif
34 (Harley & Prescott 2002). Hasil pengujian sifat katalase menunjukkan bahwa isolat m5 dan m6 memiliki enzim katalase sehingga dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut bersifat aerobik. Sedangkan isolat m2 tidak memiliki enzim katalase sehingga diduga bahwa bakteri tersebut bersifat anaerobik fakultatif.
Uji oksidase bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan enzim oksidase sitokrom. Hasil uji oksidase ini menunjukkan bahwa isolat bakteri m2 dan m6 mampu menghasilkan enzim oksidase sitrokom, sehingga bakteri tersebut melakukan metabolisme energi melalui respirasi. Hal ini terlihat pada kertas oksidase terjadi perubahan warna dari putih menjadi unggu. Sedangkan isolat bakteri m5 tidak mampu menghasilkan enzim oksidase sitrokom, sehingga bakteri tersebut tidak melakukan metabolisme energi melalui respirasi melainkan fermentasi.
Enzim oksidase mempunyai peranan penting pada sistem transpor elektron selama respirasi aerobik. Enzim oksidase sitokrom berperan sebagai katalisator dalam transfer atom hidrogen dari sitokrom yang terakhir ke molekul oksigen. Sitokrom merupakan senyawa organik yang terdapat dalam sel hidup dan berperan dalam transfer atom hidrogen dari substrat ke molekul oksigen membentuk air. Bakteri aerob, beberapa bakteri anaerobik fakultatif dan mikroaerofili, menunjukkan adanya aktivitas karena memiliki enzim oksidase (Cappucino & Sherman 1983).
Perbedaan antara proses respirasi dan fermentasi terletak pada senyawa yang berperan sebagai donor dan aseptor elektron terakhir. Pada respirasi yang berperan sebagai donor elektron adalah senyawa organik dan sebagai aseptor elektron dapat berupa oksigen maupun senyawa anorganik yang mengandung atom hidrogen. Sedangkan pada proses fermentasi, sebagai donor dan aseptor elektron terakhir adalah senyawa organik (Rabaey & Verstraete 2005).
4.6 Identifikasi Bakteri
Identifikasi adalah membandingkan sifat-sifat bakteri yang belum teridentifikasi dengan sifat-sifat bakteri sesuai dengan kunci identifikasi bakteri. Semua yang berkaitan dengan identifikasi berkaitan dengan segala sesuatu yang telah diketahui terlebih dahulu sebagai pembanding terhadap bakteri yang ingin diidentifikasi. Hasil karakterisasi pada ketiga isolat murni menjadi acuan dalam
penelaahan pada panduan buku manual yang digunakan dalam mencari genus dari
isolat bakteri. Buku manual yang digunakan ialah Bergey’s Manual (Holt et al. 1994). Setelah mendapatkan genus dari tiap isolat, maka identifikasi
isolat dapat diteruskan hingga tingkat spesies.
Pada pengamatan sebelumnya telah didapatkan ciri dan sifat ketiga isolat yang ingin diidentifikasi. Ketiga isolat tersebut memiliki karakteristik yang berbeda. Isolat m2 terlihat adanya bentuk koloni dengan penampakan atas yang bulat, penampakan samping halus, bentuk penonjolan timbul, bewarna kuning, sel berbentuk batang panjang, Gram negatif, serta memiliki motilitas. Berdasarkan buku manual identifikasi bakteri Bergey’s Manual yang digunakan, isolat m2 diduga masuk dalam kategori bakteri Grup 5. Bakteri Grup 5 adalah bakteri batang Gram negatif yang bersifat fakultatif anaerobik (Holt et al. 1994). Ciri-ciri isolat 2 yang terdapat dalam golongan Grup 5 ialah (1) tidak membentuk prosthecae, tangkai, sheaths, atau gas vakola, (2) tidak bergerak, (3) tidak bereproduksi dengan bertunas, (4) dapat pada pada udara atmosfer dan dapat tumbuh secara anaerob dengan fermentasi, dan (5) terdapat hidup bebas atau berasosiasi dengan hewan, manusia, atau tanaman sebagai inangnya. Isolat m2 diduga termasuk dalam genus bakteri Aeromonas sp.
Berbagai galur Aeromonas dapat diisolasi dari berbagai jenis air sehingga genus ini termasuk organisme akuatik. Aeromonas dapat hidup pada berbagai salinitas, konduktivitas, temperatur, pH, dan kekeruhan. Namun Aeromonas tidak ditemukan pada air dengan salinitas yang sangat tinggi atau air geotermal (suhu 45 °C atau lebih). Sedimen juga mengandung lebih banyak Aeromonas dibandingkan kolom air. Jumlah Aeromonas yang tinggi juga ditemukan pada sedimen dengan konsentrasi bahan organik yang tinggi (Farmer et al. 2006).
Isolat m5 terlihat adanya bentuk koloni dengan penampakan atas yang bulat, penampakan samping halus, bentuk penonjolan yang timbul, bewarna putih, sel berbentuk kokus, Gram negatif, serta tidak motil. Berdasarkan buku manual identifikasi bakteri Bergey’s Manual yang digunakan, isolat m5 diduga masuk dalam kategori bakteri Grup 4. Bakteri Grup 4 adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang dan kokus yang dapat tumbuh pada kondisi aerob dan beberapa anggotanya bersifat mikroaerofilik (Holt et al. 1994). Ciri-ciri isolat m5 yang
36 terdapat dalam golongan Grup 4 ialah (1) tidak membentuk prosthecae, tangkai, sheaths, atau gas vakola, (2) tidak bergerak, (3) dapat pada pada udara atmosfer
dan bermetabolisme respirasi dengan menggunakan O2sebagai penerima elektron
terakhir, beberapa dapat tumbuh secara anaerob dengan menggunakan penerima
elektron terakhir selain O2, dan (4) terdapat pada tanah, air atau lingkungan laut,
pada akar tanaman atau organ reproduksi, saluran usus, dan rongga mulut manusia dan hewan. Isolat m5 diduga memilii kekerabatan yang termasuk dalam genus bakteri Acinetobacter sp.
Acinetobacter berbentuk batang dengan diameter 0,9-1,6 µm dan panjang 1,5-2,5 µm sehingga menjadi berbentuk bulat pada fase stasioner pertumbuhannya. Sel bakteri biasanya berpasangan dan membentuk rantai. Sel tidak membentuk endospora dan tidak motil. Semua galur bakteri pada Genus Acinetobacter dapat tumbuh dalam rentang suhu 20-30 °C, namun sebagian besar galur tumbuh
optimal pada suhu 33-35 °C. oksidase negatif dan katalase positif (Holt et al. 1994). Acinetobacter pada umumnya ditemukan hidup bebas sebagai
saprofit pada tanah, air, lumpur, dan makanan (Towner 2006).
Isolat m6 terlihat adanya bentuk koloni dengan penampakan atas yang bulat, penampakan samping halus, bentuk penonjolan yang timbul, bewarna putih, sel berbentuk batang, Gram positif yang memiliki endospora, serta memiliki motilitas. Berdasarkan buku manual identifikasi bakteri Bergey’s Manual yang digunakan, isolat m6 diduga masuk dalam kategori bakteri Grup 18. Bakteri Grup 18 adalah bakteri endospora Gram positif berbentuk batang(Holt et al. 1994). Ciri-ciri isolat m6 yang terdapat dalam golongan Grup 18 ialah (1) bakteri dengan klasifikasi memiliki endospora, (2) bakteri ini bersifat Gram positif, setidaknya
pada awal kultur (usia muda) walaupun ada 1 genus yang bersifat Gram negatif, (3) berbentuk batang hingga menyerupai bulat. Bakteri tersebut sangat resisten
terhadap panas karena memiliki endospora. Endospora memberikan perlindungan dari lingkungan yang ekstrim, (4) banyak terdapat dalam bentuk batang atau berfilamen; walaupun dalam genus tertentu bersifat motil (bila dalam bentuk bulat dan berbentuk tetrad atau berkoloni), dan (6) memiliki sifat fakultatif anaerobik, mikroaerobik, anaerobik, atau aerob. Terdapat 1 genus yang bersifat anaerob dan menghasilkan sulfat. Isolat m6 diduga termasuk dalam genus bakteri Bacillus sp.
Bacillus sp. tersebar luas di berbagai lingkungan dengan berbagai spesies yang beragam. Genus Bacillus bersifat Gram positif (waupun terkadang bersifat Gram variabel atau Gram negatif), berbentuk batang, memiliki flagella, memiliki endospora berbentuk elips atau bulat, endospora membengkak atau tidak, bersifat anaerobik fakultatif atau aerobik, dan sebagian katalase positif (Claus et al. 2006). Bacillus yang diperoleh dari sampel air laut dan dasar laut biasanya bersifat halotoleran dan sebagaian beasar tidak membutuhkan media air laut untuk pertumbuhannya (Rüger et al. 2000). Isolat m6 yang telah diketahui hingga tingkat genus dilakukan uji lanjut untuk mengetahui identifikasi hingga tingkat
spesies. Uji lanjut dilakukan dengan menggunakan MicrogenTM GN-ID
Identification.