Abstrak
Kalpastatin (CAST) berperan dalam menghambat fungsi enzim kalpain yang terlibat dalam mengatur turn over protein dan pertumbuhan, sehingga gen kalpastatin (CAST) diyakini sebagai salah satu kandidat gen untuk sifat pertumbuhan dan kualitas karkas. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman gen CAST khususnya pada daerah sebagian intron 5 dan seluruh exon 6 pada domba. Metode PCR-SSCP digunakan untuk mengidentifikasi variasi pada gen CAST. Sebanyak 401 ekor domba dari 8 sub populasi digunakan dalam penelitian ini, tiga group merupakan Domba Ekor Tipis (DET) dari Sukabumi, UP3J Jonggol dan Kissar. Sisanya adalah antara lain domba Priangan dari Margawati dan Wanaraja serta Domba Ekor Gemuk (DEG) dari Donggala, Sumbawa dan pulau Rote. Analisis SSCP menunjukkan tiga pola SSCP berbeda yang merujuk pada tiga alel CAST berbeda yaitu alel CAST-1, 2 dan 3 dengan enam genotipe berbeda. Variasi genetik di antara populasi dihitung berdasarkan frekuensi alel dan genotipenya. Sebagian besar populasi yang diteliti menunjukkan polimorfisme gen CAST dengan frekuensi masing-masing genotipe CAST-11, CAST-12, CAST-22, CAST-13, CAST-23, dan CAST-33 adalah 29.7%, 38.2%, 24.2%, 2.5%, 4.5% dan 0.7%. CAST-1 dan 2 adalah alel yang paling umum pada seluruh populasi dengan total frekuensi 95.8%, sementara alel yang langka adalah CAST-3 (4.2%) dan hanya ditemukan di populasi DET. Dapat disimpulkan bahwa gen CAST bersifat polimorfik dan informasi tersebut dapat digunakan untuk mencari hubungan dengan sifat pertumbuhan, kualitas karkas dan daging domba lokal.
Abstract
Calpastatin (CAST) is an indigenous inhibitor of calpain that involved in regulation of protein turn over and growth, therefore calpastatin (CAST) gene was an excellent candidate gene for growth and carcass trait in livestock. The objective of this research was to identify genetic polymorphisms in the part of intron 5 - entire exon 6 of CAST gene. A PCR-SSCP method was carried out to identify genetic variation of CAST gene. In total 401 heads of sheep from 8 subpopulations were investigated, three groups of samples were Thin Tail Sheep from Sukabumi, Jonggol and Kissar. The rest samples were Priangan sheep from Margawati and Wanaraja and Fat Tail Sheep from Donggala, Sumbawa and Rote islands. SSCP analysis revealed that three different SSCP patterns corresponded to three different alleles in the CAST locus (CAST-1, 2 and 3 allele) with six different genotypes. Genetic variation between local sheep populations were calculated based on genotypic and allelic frequencies. Most populations studied were polymorphic, with genotype frequencies of CAST-11, CAST-12, CAST-22, CAST-13, CAST-23, and CAST-33 were 29.7%, 38.2%, 24.2%, 2.5%, 4.5% and 0.7% respectively. CAST-1 and 2 alleles were most commonly found in all populations with total frequency 95.8%, while rare allele was CAST-3 (4.2%) and only found in thin tail population. Its concluded that CAST genes were polymorphic and could be used for searching any association with growth trait, meat and carcass quality in local sheep.
Pendahuluan
Kalpastatin (CAST) merupakan salah satu enzim yang termasuk dalam bagian sistem kalpain kalpastatin yang melibatkan tiga molekul yakni : µ-kalpain, m-kalpain dan kalpastatin yang berfungsi sebagai penghambat spesifik dari kedua jenis kalpain. Sistem ini berperan dalam berbagai macam proses fisiologik dan patologik (Kidd et al. 2000; Huang et al. 2001; Goll et al. 2003; Raynaud et al. 2004) dan terlibat dalam proses pengaturan turn over protein dan pertumbuhan (Goll et al. 1992), migrasi myoblast (Dedieu et al. 2003) dan fusi myoblast
(Temm-Grove et al. 1999). Berdasarkan hal tersebut, gen CAST diyakini sebagai salah satu kandidat gen untuk sifat pertumbuhan dan kualitas karkas pada ternak.
Telah banyak penelitian yang menunjukkan hubungan polimorfisme gen CAST dengan kualitas karkas dan daging, khususnya sifat keempukan pada beberapa ternak (Schenkel et al. 2006; Casas et al. 2006; Curi et al. 2009). Pada domba, polimorfisme gen CAST dilaporkan mempunyai hubungan dengan bobot lahir (Byun et al. 2008), dan bobot badan (Sumantri et al. 2008,) namun tidak mempengaruhi sifat keempukan daging anak domba (Zhou & Hickford 2008a).
Beberapa penelitian terdahulu melaporkan polimorfisme gen CAST pada domba lokal, namun penelitian tersebut hanya fokus pada daerah intron (Sumantri et al. 2008; Sutikno et al. 2011), dan belum ada laporan keragaman pada daerah penyandi asam amino (coding region) khususnya pada domba lokal. Ekson 6 adalah ekson terbesar pada gen kalpastatin domba, dan diketahui bersifat polimorphik pada domba dengan ditemukannya lima alel yang berbeda (Zhou et al. 2007, Byun et al. 2009a). Tullio et al. (2009) melaporkan bahwa sekuen yang disandi oleh ekson 6 diketahui memiliki beberapa situs posporilasi, dan terlibat langsung dalam menentukan lokalisasi sel. Hasil tersebut menunjukkan bahwa variasi yang ada dalam sekuens ekson 6 diduga dapat mempengaruhi aktivitas ion Ca2+ channels dan kemudian dapat mengatur atau memodulasi aktivitas kalpain. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi keragaman (polimorfisme) gen CAST khususnya pada daerah penyandi asam amino (ekson 6) pada domba lokal Indonesia.
Bahan dan Metode
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April 2010 sampai April 2011. Penelitian laboratorium dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Bagian Pemuliaan dan Genetika Ternak Fakultas Peternakan IPB untuk isolasi dan purifikasi DNA, serta analisis PCR-SSCP (single strand conformational polymorphism).
Identifikasi Keragaman Gen Kalpastatin (CAST) pada Domba Lokal
Materi penelitian adalah sampel DNA genom koleksi Laboratorium Molekuler dan Genetika Ternak (LGMT) Bagian Ilmu Pemuliaan dan Genetika Fakultas Peternakan IPB, yang berasal dari tiga jenis domba lokal yakni Domba Ekor Tipis (DET), Domba Ekor Gemuk (DEG) dan Domba Priangan/Garut yang diperoleh dari beberapa daerah sub populasi domba lokal di Indonesia. Total 401 sampel DNA domba yang terbagi atas kelompok DEG dari Donggala (54), Sumbawa (29), dan pulau Rote (12), kelompok DET dari UP3J Jonggol (52) Kab. Bogor milik Fakultas Peternakan IPB, Kissar Maluku (32 ekor), dan Sukabumi (161) serta kelompok domba Priangan/Garut dari Margawati (26 ekor) (Garut Pedaging) dan Wanaraja (35 ekor) (Garut Tangkas) Kabupaten Garut, Jawa Barat.
Teknik Pengambilan Sampel Darah
Pengambilan sampel darah dilakukan dengan mengumpulkan sekitar 5 ml sampel darah dari domba melalui vena jugularis dengan menggunakan venojet
dan tabung vacuttainer tanpa heparin. Sampel darah tersebut kemudian diawetkan dengan etanol absolute dengan perbandingan 1:1 dan kemudian disimpan pada suhu ruang.
Ekstraksi DNA Genom
Ekstraksi DNA genom dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan metode standar phenol chloroform (Sambrook et al. 1989) yang dimodifikasi oleh Andreas et al. (2010) dengan menggunakan enzim Proteinase K dan Phenol- Chloroform untuk mendegradasi protein dan lemak kemudian dipresifitasi menggunakan etanol absolut. DNA hasil ekstraksi kemudian ditambahkan larutan TE 80% dan siap untuk analisis PCR.
Analisis PCR-SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism)
Fragmen gen CAST domba diidentifikasi dengan menggunakan metode PCR-SSCP (single strand conformational polymorphism). Fragmen intron 5 - ekson 6 diamplifikasi dengan runutan primer F:5’-GTTATGAAT TGCTTTCTACTC-3’ dan primer R: 5’-ATACGATTGAGAGACTTCAC-3’ berdasarkan Zhou et al. (2007) dengan prediksi panjang produk PCR sekitar 254 bp.
Sampel DNA dari masing-masing individu digunakan sebagai cetakan untuk mengamplifikasi lokus gen CAST melalui reaksi PCR dengan sekuen nukleotida pengapit masing-masing (Primer Forward dan Reverse). Amplifikasi dilakukan dengan PCR dikondisikan pada volume reaksi 25 μl yang terdiri atas 50 - 100 ng DNA template, 0.25 μM primer, 150 μM dNTP (Fermentas), 2.5 mM Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase (Fermentas) dan 1x buffer. Kondisi mesin PCR dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 94oC selama 5 menit, diikuti dengan 35 siklus berikutnya masing-masing 94oC selama 30 detik (tahap denaturasi), 56oC selama 45 detik (tahap annealing), 72oC selama 45 detik (tahap ekstensi), yang diakhiri dengan satu siklus ekstensi akhir pada suhu 72oC 5 menit dengan menggunakan mesin PCR (Mastercycler Personal 22331, Eppendorf, Jerman). Produk PCR kemudian dielektrophoresis pada gel agarose 1.5%, dengan buffer 0.5x TBE yang mengandung 200 ng/ml ethidium bromide. Kemudian divisualisasi pada UV transiluminator.
Identifikasi konformasi DNA utas tunggal (single strand conformational), dilakukan dengan mencampur 5 μl produk PCR dengan 5 μl formamide dye (98% formamide, 10 mM EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol). Kemudian sampel didenaturasi pada suhu 95oC selama 5 menit, dan langsung didinginkan dalam ice bath dan diloading pada gel poliakrilamid (29:1) 12%. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan Protean II xi cells (Bio-Rad) pada kondisi 300 V, suhu 5 oC selama 18 jam pada larutan TBE buffer 0.5x. Setelah elektrophoresis gel kemudian dilakukan pewarnaan dengan silver- stainning berdasarkan metode Byun et al. (2009b) yang dimodifikasi pada larutan stainning (0.1% AgNO3, 0.04% NaOH 10 N dan 0.4% NH3).
Penentuan Posisi Pita DNA dan Genotipe Gen CAST
Penentuan posisi pita DNA pada gel poliakrilamid dilakukan secara manual. Ukuran dan jumlah dari alel yang muncul pada gel ditentukan berdasarkan asumsi bahwa semua pita DNA dengan laju migrasi yang sama adalah homolog, sedangkan alel dengan migrasi paling cepat ditetapkan sebagai alel 1, berikutnya adalah alel 2 dan seterusnya.
Analisis Sekuensing DNA
Sampel yang menunjukkan pola pita SSCP yang berbeda dilanjutkan untuk analisis sekuensing. Analisis ini untuk menyakinkan hasil polimorfisme yang diperoleh dari hasil analisis PCR-SSCP. Sampel-sampel yang menunjukkan pola SSCP berbeda dan dalam keadaan homozigot yang digunakan sebagai cetakan DNA untuk sekuensing. Sebelum sekuensing, salah satu pita unik yang mewakili tiap-tiap alel diambil dari gel dan kemudian dipurifikasi mengikuti metode yang dijelaskan oleh Hu et al. (2010). Sampel tersebut kemudian diamplifikasi (PCR) ulang, untuk memastikan identitas produk yang dihasilkan, maka produk PCR hasil purifikasi dikonfirmasi ulang dengan produk PCR sampel DNA genom melalui analisis PCR-SSCP secara bersamaan.
Perbandingan, translasi serta aligment sekuens dilakukan dengan menggunakan software MEGA versi 4 (Tamura et al. 2008). Program BLAST
(basic local alignment search tool) digunakan untuk mencari homologi sekuens dengan sekuens yang ada di GenBank NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Analisis Statistik
Frekuensi alel dan genotipe dihitung berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000).
dimana Xii = frekuensi genotipe ii, Xi = frekuensi alel ke-i, nii = jumlah sampel
dengan genotipe ii, nij=jumlah sampeldengan genotipe ij, dan N= total sampel. Test keseimbangan Hardy-Weinberg (HWE) dengan uji chi-square (Kaps & Lamberson 2004).
dimana χ² = chi-square , Obs = jumlah genotipe ke-ii hasil pengamatan, dan Exp
= jumlah genotipe ke-ii yang diharapkan.
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He)
berdasarkan rumus heterozigositas Nei dan dihitung dengan menggunakan
software PopGene32 versi 1.31 (Yeh et al. 1999).
dimana Ho = heterozigositas pengamatan di antara populasi, He = heterozigositas
harapan di antara populasi, = ukuran relatif populasi, Xkij(i≠j) = frekuensi AiAj
Hasil dan Pembahasan
Keragaman Gen Kalpastatin (CAST)
Sebagian daerah intron 5 dan seluruh bagian ekson 6 pada fragmen gen CAST berhasil diamplifikasi dengan primer forward dan reverse, dengan prediksi panjang produk PCR 254 bp (Gambar 4). Hasil analisis PCR-SSCP menunjukkan polimorfisme pada daerah ini dengan ditemukannya tiga pola SSCP yang berbeda yang merujuk pada tiga alel yang berbeda, alel CAST-1, CAST-2 dan CAST-3. Baik satu atau dua pita unik yang berbeda ditemukan pada tiap individu yang menunjukkan individu tersebut homozigot atau heterozigot dengan enam genotipe yang berbeda, yakni CAST-11, CAST-12, CAST-22, CAST-13, CAST-23 dan CAST-33.
Level polimorfisme yang ditemukan pada penelitian ini lebih rendah dibanding yang dilaporkan oleh Zhou et al. (2007) yang menemukan lima alel berbeda pada domba Merino, Corriedale, Poll Dorset dan NZ crossbreed. Namun, hasil ini lebih tinggi dibanding yang dilaporkan pada domba lokal Indonesia (dengan PCR-RFLP) (Sumantri et al. 2008; Sutikno et al. 2011), domba Karakul Iran (Shahroudi et al. 2006) dan domba Kurdi (Nassiry et al. 2006)
Gambar 4 Produk PCR gen kalpastatin (CAST), M (marker) = 100 bp ladder, 1 – 8 = individu sampel
Alel yang paling umum ditemukan adalah alel CAST-1 dan CAST-2 dengan frekuensi sebesar 50% dan 45.8% dengan total frekuensi keduanya 95.8%, sementara alel CAST-3 adalah alel langka dengan frekuensi dipopulasi hanya berkisar 4.2%. Genotipe yang paling umum ditemukan adalah CAST-12 (38.2%). Zhou et al. (2007) juga menemukan alel CAST-1 dan CAST-2 sebagai alel yang paling umum, dengan total frekuensi 82% pada populasi domba Merino, Corriedale, Romney, Poll Dorset dan NZ cross-breed, sementara alel yang langka adalah CAST-3 (13%), CAST-4 (2%) dan CAST-5 (3%). Gambar 5 menunjukkan genotipe gen CAST hasil elektroforesis setelah SSCP.
Gambar 5 Pola pita SSCP (single strand conformational polymorphism) gen kalpastatin (CAST)
Frekuensi genotipe CAST-11 pada kelompok DEG dari populasi Sumbawa, Rote dan Donggala berkisar 8% sampai 16.7%. Nilai tersebut lebih rendah dibanding dengan kelompok domba Priangan dari populasi Margawati (85.0%) atau DET dari populasi Jonggol (42.3%). Frekuensi genotipe CAST-12 pada kelompok DEG berkisar 10.3% sampai 83.3% dan lebih tinggi dibanding populasi domba Priangan dari Wanaraja (57.1%) dan populasi DET dari Kissar (53.1%). Sementara frekuensi CAST-22 pada DEG berkisar 8.3% sampai 79.3% lebih tinggi dibanding populasi domba priangan dan DET. Genotipe CAST-23 hanya ditemukan pada populasi DET (Sukabumi, Kissar dan Jonggol), dengan frekuensi tertinggi pada sub populasi Kissar (15.6%). Genotipe CAST-13 (6.2%) dan CAST-33 (1.9%) hanya ditemukan pada sub populasi Sukabumi.
Tabel 1 Frekuensi genotipe dan alel gen CAST pada domba lokal
Populasi N Genotipe CAST Alel CAST
11 12 22 31 32 33 1 2 3 Donggala (DEG) 54 0.167 0.481 0.352 0.000 0.000 0.000 0.407 0.593 0.00 Sumbawa (DEG) 29 0.103 0.103 0.793 0.000 0.000 0.000 0.155 0.845 0.00 Rote (DEG) 12 0.083 0.833 0.083 0.000 0.000 0.000 0.500 0.500 0.00 Sukabumi (DET) 161 0.335 0.311 0.199 0.062 0.075 0.019 0.522 0.391 0.087 Kissar (DET) 32 0.281 0.531 0.031 0.000 0.156 0.000 0.547 0.375 0.078 Jonggol (DET) 52 0.269 0.462 0.250 0.000 0.019 0.000 0.500 0.490 0.010 Margawati (DP) 26 0.808 0.115 0.077 0.000 0.000 0.000 0.865 0.135 0.00 Wanaraja (DP) 35 0.229 0.571 0.200 0.000 0.000 0.000 0.514 0.485 0.00 Total 401 0.297 0.382 0.244 0.025 0.045 0.007 0.500 0.458 0.042
N = Jumlah sampel (ekor), DEG = Domba Ekor Gemuk, DET = Domba Ekor Tipis, dan DP = Domba Priangan
Penelitian lain dengan menggunakan teknik PCR-RFLP melaporkan polimorfisme kalpastatin (lokus CAST-Msp1) pada domba lokal dengan dua tipe alel (M dan N), namun hanya menemukan dua genotipe (MN dan NN) dengan frekuensi masing-masing 25% dan 75%, dan 13% dan 87% untuk frekuensi alel M dan N (Sumantri et al. 2008).
Tabel 2 Frekuensi genotipe observasi dan harapan gen CAST pada domba lokal
Genotipe Obs. Freq (O) Exp. Freq (E) X2 (chi-square) X2 tabel (0.05; 3)
CAST-11 119 100.12 21.91* 7.82 CAST-12 153 183.72 CAST-22 CAST-31 CAST-32 CAST-33 98 10 18 3 83.84 17.02 15.57 0.70 Total 401 401
* = Tidak setimbang (not equilibrium)
Hasil uji chi-square (X2) menunjukkan distribusi keenam genotipe gen CAST pada populasi tidak tersebar sesuai dengan kesetimbangan Hardy- Weinberg (Tabel 2). Alel CAST-3 yang hanya ditemukan pada populasi DET, kemungkinan disebabkan perkawinan tidak terjadi secara acak atau disebabkan oleh faktor seleksi, migrasi atau mutasi (Bourdon 2000; Noor 2008).
Tabel 3 Nilai heterosigositas pengamatan dan harapan gen CAST pada domba lokal
Heterozigositas
Populasi N Ho He Nei* Rataan
Donggala (DEG) Sumbawa (DEG) Rote (DEG) Sukabumi (DET) Kissar (DET) Jonggol (DET) Margawati (DP) Wanaraja (DP) 54 29 12 161 32 52 26 35 0.481 0.103 0.833 0.447 0.687 0.480 0.115 0.571 0.487 0.266 0.521 0.568 0.563 0.514 0.237 0.506 0.482 0.262 0.500 0.567 0.554 0.509 0.233 0.499 Total 401 0.451 0.539 0.538 0.451
N = jumlah sampel (ekor), Ho = Heterosigositas pengamatan, *He = Heterosigositas harapan menurut Levene (1949) dan Nei’s (1973).
Menurut Nei dan Kumar (2000), keragaman genetik dapat diukur berdasarkan nilai heterozigositas. Nilai heterozigositas pengamatan (0.451), heterozigositas harapan (0.539), dan heterozigositas rata-rata (0.451) dari lokus gen CAST pada domba lokal berada pada taraf medium. Heterozigositas harapan dan pengamatan serta nilai heterozigositas harapan berdasarkan rumus Nei pada lokus CAST di tiap-tiap populasi terdapat pada Tabel 3.
Analisis Sekuens Lokus Gen CAST (intron 5 - ekson 6)
Sampel yang mewakili tiga macam alel berbeda yang homozigot kemudian disekuensing untuk memastikan perbedaan susunan nukleotida pada ketiga macam alel tersebut. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa produk PCR yang diperoleh memiliki panjang yang bervariasi dari 253 sampai 254 bp. Hal tersebut disebabkan pada alel CAST-3 terdapat delesi pada posisi basa ke-69 (No. Akses GenBank: DQ414517). Di samping itu, perbedaan alel CAST-3 juga terdapat pada posisi basa ke-65 dimana terjadi perubahan dari basa G ke T dan pada posisi basa ke-96 perubahan dari A ke T relatif terhadap sekuens alel CAST-1 (No. Akses GenBank: DQ414513) dan CAST-2 (No. Akses GenBank: DQ414514). Perbedaan alel CAST-1 dengan CAST-2 terletak pada perbedaan runutan
nukleotida pada posisi basa ke-62 (perubahan G ke A). Perubahan basa alel CAST-3 pada posisi basa ke-96 di daerah ekson 6 merupakan non synonymous mutation yang merubah susunan asam amino dari Glutamina (Gln) menjadi Leusina (Leu).
Runutan nukleotida dari masing-masing genotipe ditunjukkan pada Gambar 6. Berdasarkan homologi sekuens gen CAST pada sapi (No. Akses GenBank: EF443057), ekson 6 gen adalah ekson terbesar dengan panjang sekitar 114 pb yang mengkode sekitar 38 residu asam amino (Raynaud et al. 2005; Zhou & Hickford 2008c).
Seluruh variasi nukleotida yang diidentifikasi sama dengan yang dilaporkan sebelumnya oleh Zhou et al. (2007). Fungsi variasi susunan asam amino pada ekson 6 belum diketahui, namun kalpastatin memiliki saluran pengatur ion Ca2+ yang berada di L domain (Hao et al. 2000) dan diduga sekuen yang mengkode ekson 6 memiliki beberapa situs phosporilasi dan terlibat langsung dalam penentuan lokalisasi sel pada kalpastatin (Tullio et al. 2009). Variasi tersebut kemungkinan dapat mempengaruhi aktivitas Ca2+ channel dan mengatur atau memodulasi aktivitas kalpain. Variasi di daerah intron mungkin dapat mempengaruhi pembentukan RNA serta fungsi dan level ekspresi kalpastatin (Zhou et al. 2007).
Polimorfisme ekson 6 gen CAST pada kambing juga dilaporkan oleh Zhou dan Hickford (2008c), yang mengidentifikasi variasi asam amino non-synonymous
yang menghasilkan perubahan susunan dari Ser/Arg pada domain L protein kalpastatin. Sebuah mutasi SNP (T>C) (synonymous mutation) juga diidentifikasi pada ekson 6 gen CAST sapi (Zhou & Hickford 2008a).
Gambar 6 Runutan nukleotida alel CAST-1, CAST-2 dan CAST-3
Simpulan
Lokus intron 5 - ekson 6 gen CAST pada domba lokal bersifat polimorfik dengan ditemukan tiga macam alel (CAST-1, CAST-2 dan CAST-3) dengan enam macam genotipe. Alel yang paling umum adalah CAST-1 (50%) dan CAST-2 (45.8%), sedangkan genotipe yang paling umum adalah CAST-12 (38.2%). Ditemukan variasi asam amino pada daerah ekson 6 yang merubah susunan asam amino dari Glutamina (Gln) menjadi Leusina (Leu). Informasi keragaman gen CAST selanjutnya dapat digunakan untuk studi mencari hubungan keragaman tersebut dengan sifat pertumbuhan seperti berat lahir, berat sapih, pertambahan berat badan harian (daily gain) serta kualitas karkas dan daging pada domba lokal Indonesia.