KERAGAMAN GENETIK PERONOSCLEROSPORA DI INDONESIA

INDONESIA BERBASIS KERAGAMAN MORFOLOG

4 KERAGAMAN GENETIK PERONOSCLEROSPORA DI INDONESIA

Pendahuluan

Penelitian sebelumnya tentang morfologi pseudo fungi penyebab bulai jagung di Indonesia menunjukkan keragaman yang tinggi diantara spesies penyebab. Oleh karena itu studi keragaman genetik sebagai lanjutan dari analisis keragaman morfologi perlu dilakukan. Terlebih lagi ada peluang pemberian nama spesies baru untuk spesimen P. sorghi asal NTT. Penelitian keragaman genetik patogen penyebab penyakit dilakukan dalam rangka menggali pengetahuan keragaman genetik yang selanjutnya akan dimanfaatkan dalam usaha pengembangan kultivar tahan penyakit. Pengetahuan tentang keberadaan patotipe di suatu lokasi penting diketahui untuk kegiatan penapisan ketahanan suatu kultivar (Muis et al. 2013).

Keragaman genetik suatu mahluk hidup sangat erat berhubungan dengan proses evolusi genetikanya. Evolusi dalam skala mikro dapat terjadi dilingkup mahluk hidup termasuk mikroorganisme. Penelitian evolusi mikroorganisme penting untuk mengendalikan dan memprediksi perilaku mikroorganisme, terlebih mikroorganisme penyebab penyakit tanaman. Oleh karena itu penelitian berkenaan dengan sejarah evolusi mahluk hidup terus berkembang hingga sekarang. Penelitian yang mendukung sejarah evolusi dilakukan melalui pendekatan studi komparatif morfologi dan fisiologi mahluk hidup, termasuk evolusi pseudo fungi anggota Oomycetes (Taylor et al. 1999; Nei dan Kumar 2000).

Pengetahuan biologi molekuler yang pesat akhir-akhir ini turut serta berperan dalam perkembangan kajian evolusi Oomycetes. Seperti telah dilaporkan bahwa penelitian tingkat molekuler pseudo fungi Oomycetes tidak semaju pseudo fungi lain. Shaw dalam Schronack (2009) menyebut pseudo fungi Oomycetes sebagai fungal genetic’s nightmare di awal tahun 1980-an, namun sejak pertengahan 90-an mengalami titik terang sehingga berubah menjadi fungal

genomic’s dream. Titik terang perkembangan evolusi pseudo fungi Oomycetes

dapat dilihat dari hasil studi tentang pola hubungan pseudo fungi dengan inang yang baru diketahui melibatkan beberapa molekul, selanjutnya studi tentang keragaman genetik antar spesies, serta studi tentang kladogram pseudo fungi anggota Oomycetes (Kamoun 2003; Rietman et al. 2010).

Evolusi skala mikro pseudo fungi dalam jangka waktu panjang akan menyebabkan perubahan genetik pseudo fungi. Perubahan genetik sebagai salah bentuk adaptasi pseudo fungi terhadap lingkungan menyebabkan keragaman ditingkat spesies pseudo fungi. Menurut Agrios (2005), keragaman genetik dapat terjadi di tingkat spesies mikroorganisme penyebab penyakit tanaman dan tingkat tanaman. Perubahan genetik di tingkat mikroorganisme akan memicu perubahan di tingkat tanaman. Perubahan yang saling mempengaruhi ini dikenal dengan istilah koevolusi.

Koevolusi antara tanaman dan pseudo fungi penyebab penyakit tanaman dapat terjadi dengan cepat atau lambat. Koevolusi yang cepat akan menyebabkan keragaman genetik yang tinggi. Keragaman genetik yang tinggi akan menyulitkan dalam pengelolaan dan pengendalian penyakit di tingkat lapangan (McDonald

37 1997). Oleh karena itu studi tentang keragaman genetik sangat diperlukan dalam menunjang strategi pengendalian penyakit tanaman.

Keragaman genetik pseudo fungi Peronosclerospora penyebab bulai pada beberapa serealia diketahui sangat tinggi. Keragaman ini berlaku spesifik lokasi, spesifik inang, dan spesifik kondisi iklim suatu daerah. Penelitian keragaman genetik pada genus tersebut menunjukkan bahwa lokasi yang berbeda akan berbeda juga karakter genetika pseudo fungi penyebab. Di Indonesia, pada beberapa spesimen yang diteliti sebelumnya diketahui terdapat 3 kelompok spesies Peronosclerospora. Hasil karakterisasi beberapa spesimen menunjukkan adanya 3 kelompok yang berbeda sesuai lokasi, yakni kelompok Kediri, kelompok Medan, dan kelompok Maros. Namun demikian penelitian tersebut masih perlu diperdalam lagi pada area yang lebih luas yang mewakili area di seluruh wilayah Indonesia, sehingga diperoleh peta daerah sebar pseudo fungi penyebab berikut kondisi keragaman genetiknya.

Keragaman genetik antar spesimen pseudo fungi dapat dideteksi melalui pengembangan marka molekuler, salah satu diantaranya SSR (Simple Sequence Repeat). Beberapa primer berbasis SSR telah dirancang untuk amplifikasi mikrosatelit dan telah diuji kemampuannya untuk membedakan patogenesitas beberapa spesimen P. sorghi dan untuk membedakan antar spesies patogen bulai lainnya seperti P. philippinensis, P. maydis, P. sacchari, Sclerospora graminicola dan P. sparsa. Primer yang dirancang berbasis SSR ternyata lebih efektif digunakan untuk membedakan keragaman antara spesimen spesies Peronosclerospora pada jagung dibanding marka molekuler RAPD (Perumal 2008; Hikmawati et al. 2011).

Namun analisis SSR terkendala oleh peralatan yang kurang sederhana sehingga membutuhkan keahlian khusus dalam penanganan metode SSR. Pengembangan analisis keragaman Peronosclerospora berbasis cytochrome oxidase dan ITS belum pernah dilakukan di Indonesia. Analisis ini lebih sederhana dibanding analisis filogeni menggunakan marka molekuler seperti SSR. Terlebih lagi informasi tentang keragaman genetik yang telah ada sebelumnya belum mewakili keseluruhan wilayah Indonesia. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan mengetahui keragaman genetik beberapa spesimen Peronosclerospora penyebab penyakit bulai yang diperoleh dari beberapa lokasi berbeda geografis yang mewakili seluruh wilayah sentra produksi dan bukan produksi jagung di Indonesia. Selanjutnya informasi tentang keragaman genetik digunakan dalam penyusunan kladogram berbasis keragaman genetik spesimen yang mewakili daerah geografis di Indonesia.

Bahan dan Metode

Identifikasi Spesimen Peronosclerospora spp. dari Beberapa Ketinggian Identifikasi molekuler dengan metode PCR dilakukan sebagai uji konfirmasi hasil pengamatan morfologi menggunakan primer spesifik spesies yang telah divalidasi pada penelitian sebelumnya. DNA contoh diambil dari daun yang sama untuk induksi sporulasi, asal 20 titik survei yang mewakili kondisi ketinggian tempat di-13 provinsi di Indonesia. DNA pseudo fungi diekstraksi dengan cara

ekstraksi DNA total dari daun jagung bergejala bulai, menggunakan FastDNA Spin Kit Lysing Matrix A (MPBio) dengan alat ekstraksi FastPrep 24 (MPBio). Reaksi PCR dilakukan menggunakan Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo) pada mesin Verity 96-well (Applied Biosystem). Primer spesifik yang digunakan adalah primer yang direkomendasikan pada hasil penelitian pertama tentang pemetaan pseudo fungi penyebab bulai jagung berbasis keragaman morfologi dan molekuler. Hasil PCR diuji lebih lanjut menggunakan DNA sequenser, yang kemudian dianalisis homologi dan kaidah molekuler lain, diantaranya e-value dan query cover dengan data yang tersedia di NCBI menggunakan perangkat lunak BLAST.

Analisis Keragaman Genetik Spesimen Peronoscleropora spp.

Fragmen DNA hasil amplifikasi PCR dimanfaatkan untuk perunutan DNA guna mengetahui susunan nukleotida masing-masing spesimen yang bereaksi positif menggunakan primer specific spesies. Perunutan DNA dilakukan menggunakan Abiprism model 3100 versi 3.7 di PT. Genetika Science Indonesia dengan primer rekomendasi untuk masing-masing spesies pseudo fungi bulai. Runutan nukleotida hasil perunutan terlebih dulu dimodifikasi (triming) lewat fasilitas yang terdapat di Bioedit V7.0.5. Nukleotida hasil perunutan memakai primer forward dan primer reverse yang telah dimodifikasi selanjutnya disatukan dengan fasilitas contig yang tersedia pada program Bioedit. Runutan nukleotida hasil konsensus pasangan primer tersebut selanjutnya menjadi bahan analisis keragaman genetik. Analisis homologi nukleotida spesimen temuan memakai perangkat lunak BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) yang tersedia di situs National Center for Biotechnology Information (NCBI). Keragaman genetik dan kekerabatan dianalisis lebih lanjut oleh perangkat lunak MEGA6.0 dengan metode Neighbour Joining (NJ) terhadap nukleotida konsensus hasil contig. Variasi nukleotida dianalisis melalui pensejajaran DNA spesimen temuan dengan spesimen yang tersimpan di pangkalan data NCBI (GenBank) menggunakan perangkat lunak Bioedit. Variasi nukleotida tertinggi ditunjukkan adanya shading berwarna paling terang di bagian nukleotida yang bervariasi. Runutan nukleotida contig kemudian ditranslasi ke asam amino melalui Translate Nucleic Acid Sequence yang tersedia di Online Analysis Tool (www.molbiol-tool.ca). Keragaman genetik berbasis asam amino dianalisis dengan perangkat lunak Clustal Omega. Area konservasi dan variasi tinggi dapat diketahui menggunakan perangkat lunak Jalview Version 2 (Waterhouse et al. 2009).

Hasil

Identifikasi Peronosclerospora spp. Menggunakan Primer Spesifik

Empat pasang primer spesifik spesies yang telah direkomendasikan pada penelitian pertama, berhasil mengamplifikasi DNA 3 spesies Peronosclerospora spp. yang berasal dari 20 lokasi terpilih yang mewakili ketinggian tempat di-13 provinsi di Indonesia (Gambar 11). Amplifikasi DNA menggunakan pasangan

39 primer untuk spesies selain P. maydis, P. sorghi, P. philippinensis, tidak menghasilkan pita pada penelitian sebelumnya, oleh karena itu tidak diproses ke tahap analisis molekuler lebih lanjut.

Fragmen DNA hasil amplifikasi menggunakan primer spesifik spesies yang telah direkomendasikan pada penelitian pertama, kemudian dirunut. Hasil runutan nukleotida kemudian dimodifikasi dan selanjutnya dianalisis homologi menggunakan BLAST. Hasil BLAST menunjukkan bahwa spesimen P. sorghi asal Indonesia mempunyai homologi dengan spesimen asal AS dan asal Jerman. Analisis sikuen DNA lebih lanjut menggunakan DNA sequencing menunjukkan bahwa spesimen pseudo fungi Kelompok 1 yang teridentifikasi secara morfologi sebagai P. maydis mempunyai kemiripan dengan spesimen Peronosclerospora maydis asal Indonesia, yang telah didepositkan di GenBank dengan nomor asesi HM988975, HM988976, HM988977, dan HM988978. Hasil analisis sikuen DNA terhadap spesimen yang teridentifikasi secara morfologi sebagai P. sorghi menunjukkan bahwa DNA temuan mempunyai kemiripan dengan spesimen P. sorghi strain 2 asal Jerman yang sudah didepositkan di GenBank dengan nomor asesi HQ261790 kecuali spesimen P. sorghi asal NTT. Spesimen asal NTT berhomolog dengan spesimen asal Texas, AS dengan nomor asesi AY286225. Hal ini menambah informasi tentang peluang spesimen P. sorghi asal NTT sebagai kandidat spesies baru seperti telah diusulkan pada bab sebelumnya.

Spesimen P. philippinensis identik dengan spesimen asal Laguna, Filipina dan spesimen P. sacchari asal Taiwan dengan persen identik berkisar 88-100%. Spesimen Bitung Sulawesi Utara sama dengan spesimen P. philippinensis Laguna Filipina dan P. sacchari asal Taiwan, yang ditunjukkan oleh persen identik sebesar 100%. Namun demikian spesimen P. maydis yang sebagian besar mendominasi spesies temuan mempunyai homologi dengan spesimen asal Malang, Jawa Timur. Persen maksimum homologi berkisar antara 87-100% (Tabel 5).

Gambar 11 Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi dengan A) Primer PpUF/PpUR pada el agarosa 2% ( M) Penanda DNA 100pb (ThermoSci), (1) Kontrol negatif, (2) Spesimen Peronosclerospora philippinensis asal Lampung, (3) Takalar, (4) Maros, (5) Minahasa Selatan, (6) Kontrol positif P. philippinensis, B) Primer PmUF/PmUR pada gel agarosa 1.5% (1) Spesimen P. maydis asal Sukabumi, (2) Purwokerto, (4) Madura, (5) Maros, (6) Kontrol positif P. maydis , C) Primer PsUF/PsUR pada gel agarosa 1.5%, (1) Spesimen P. sorghi asal Lampung, (2) Bogor, (3) Malang, (4) Bengkayang, (5) Maros, (6) Takalar, (7) NTT, (8) Kontrol positif P. sorghi, (M) Penanda DNA 100pb (ThermoSci)

Tabel 5 Persen homologi maksimum, nilai e-value, dan query cover spesimen Peronosclerospora spp. yang ditemukan di beberapa kriteria ketinggian tempat (rendah, sedang, tinggi) dengan sikuen yang tersedia di NCBI

Identitas spesimen

Pangkalan data NCBI Nomor asesi Spesimen/Asal Homologi maksimum

(%)

e-value Query Cover (%)

Pm Sukabumi, rendah HM988976 Pm/Malang 99 1e-161 98

Pm Bogor, rendah HM988976 Pm/Malang 99 5e-161 94

Pm Purwokerto, rendah HM988976 Pm/Malang 89 3e-103 99

Pm Tegal, rendah HM988976 Pm/Malang 89 3e-103 98

Pm Maros, rendah HM988978 Pm/Malang 94 2e-104 99

Pm Madura, rendah HM988976 Pm/Malang 90 5e-73 98

Ps Bogor, sedang HQ261790 Ps/Jerman 100 5e-73 98

Ps Sulut, rendah HQ261790 Ps/Jerman 100 3e-72 99

Ps Bengkayang, rendah HQ261790 Ps/Jerman 100 1e-74 100

Ps Takalar, rendah HQ261790 Ps/Jerman 99 5e-73 98

Ps Maros, rendah HQ261790 Ps/Jerman 100 4e-74 99

Ps NTT, rendah AY286225 Ps/Texas 97 8e-16 97

Ps Malang, tinggi HQ261790 Ps/Jerman 100 4e-74 99

Pp Takalar, rendah JF754978/ JF754979 Pp/Filipina Psa/Taiwan 99 99 5e-49 5e-49 100 100 Pp Maros, rendah JF754978/ JF754979 Pp/Filipina Psa/Taiwan 93/ 93 2e-14/ 2e-14 57 57 Pp Lampung, rendah JF754978/ JF754979 Pp/Filipina Psa/Taiwan 88/ 88 7e-13/ 7e-13 100 100 Pp Minahasa, rendah JF754978/ JF754979 Pp/Filipina Psa/Taiwan 97/ 97 2e-48/ 2e-48 100 100 Pp Bitung, rendah JF754978/ JF754979 Pp/Filipina Psa/Taiwan 100/ 100 9e-52/ 9e-52 100 100 Keterangan: Pm= spesimen Peronosclerospora maydis; Ps = spesimen P. sorghi;

Pp = spesimen P. philippinensis; Psa= spesimen P. sacchari Analisis Keragaman Genetik Peronosclerospora di Indonesia

Kladogram disusun berdasarkan pendekatan Neigbour Joining (NJ) dengan perangkat lunak MEGA6. Nilai bootstrap pada penyusunan kladogram dianalisis dengan 1000x pengulangan. Analisis filogeni berdasarkan cytochrome oxidase menunjukkan adanya satu klade yang terdiri atas dua kelompok organisme yakni kelompok I terdiri atas spesies P. maydis dan kelompok II adalah P. sorghi. Kedua kelompok terpisah dari isolat P. philippinensis asal Filipina sebagai out of group. Hal ini mendukung kunci identifikasi morfologi, yakni spesimen P. maydis dan P. sorghi berada dalam satu klade. Spesimen P. maydis temuan mempunyai kedekatan dengan spesimen asal Malang Jawa Timur yang telah tersedia di NCBI oleh peneliti sebelumnya. Spesimen P. sorghi asal Indonesia berdekatan dengan spesimen asal Jerman, kecuali spesimen asal NTT yang menunjukkan kesamaan dengan spesimen P. sorghi patotipe 3 asal Texas, AS (Gambar 12).

Gambar 12 Kladogram hubungan antara spesimen Peronosclerospora spp. dari beberapa lokasi di Indonesia berbasis cytochrome oxidase (COX) untuk P. maydis dan P. sorghi dengan P. philippinensis yang dideposit di pangkalan data NCBI sebagai spesies out of group. Analisis yang didasarkan pada metode Neighbour Joining (NJ) dengan nilai ulangan bootstrap 1000x yang tersedia di perangkat lunak MEGA6.0 menunjukkan 2 kelompok yang terpisah berbasis COX. Kelompok 1 terdiri atas spesimen P. maydis dan kelompok 2 terdiri atas spesimen P. sorghi.

Keragaman genetik spesimen P. maydis berbasis molekuler dianalisis lebih lanjut menggunakan metode pensejajaran sikuen DNA antar spesimen temuan dengan spesimen P. maydis yang dideposit di NCBI. Hasil pensejajaran sikuen DNA menunjukkan adanya variasi sangat tinggi pada sikuen DNA beberapa urutan nukleotida (Gambar 13). Analisis filogeni sikuen DNA menunjukkan bahwa spesimen temuan berkelompok menjadi kelompok 1 terdiri atas P. maydis asal Bogor, Sukabumi, dan Maros, dan kelompok 3 terdiri atas spesimen P. maydis asal Madura, Purwokerto, dan Tegal yang berkerabat dekat dengan spesimen HM988979 asal Thailand. Spesimen P. maydis asal Maros menunjukkan variasi di beberapa nukleotida. Spesimen P. maydis yang terdeposit di NCBI mengelompok sendiri menjadi kelompok 2 (Gambar 14).

Pm_HM988978-Malang_Indonesia Pm_HM988977-Malang_Indonesia Pm_HM988976-Malang_Indonesia Pm_Sukabumi-Rendah Pm_Bogor-Rendah Pm_Maros-Rendah Pm_HM988979-Thailand Pm_Madura-Rendah Pm_Tegal-Rendah Pm_Purwokerto-Rendah 1 Pspato3_AY286225-Texas_AS Ps_AY286224-MeadNE_AS Ps_HQ261790-strain2_Jerman Ps_Bengkayang-Rendah Ps_Bogor-Sedang Ps_NTT-Rendah Ps_Takalar-Rendah Ps_Maros-Rendah Ps_Malang-Tinggi 2 Pp_JF754979-Filipina 52 41 84 35 34 22 56 49 17 15 14 84 99 33 28 10 19

Gambar 13 Kladogram spesimen Peronosclerospora maydis (Pm) hasil survei dan spesimen P. maydis yang tersimpan di pangkalan data NCBI

Gambar 14 Variasi sangat tinggi (blok merah) urutan nukleotida (kotak merah) DNA hasil pensejajaran spesimen Peronosclerospora maydis (Pm) hasil survei dengan spesimen P. maydis yang tersimpan di pangkalan data NCBI, serta perbedaan nukleotida spesimen Maros dibanding spesimen lainnya (kotak kuning)

Pm_Bogor-Rendah Pm_Maros-Rendah Pm_Sukabumi-Rendah Pm_HM988976-Malang_Indonesia Pm_HM988977-Malang_Indonesia Pm_HM988978-Malang_Indonesia Pm_HM988979-Thailand Pm_Madura-Rendah Pm_Purwokerto-Rendah Pm_Tegal-Rendah 41 72 38 78 100 34 99

Gambar 15 Kladogram spesimen Peronosclerospora sorghi (Ps) hasil survei dan spesimen P. sorghi yang tersimpan di pangkalan data NCBI menunjukkan 3 kelompok, yakni kelompok 1 (terdiri atas spesimen P. sorghi asal Bogor, Malang, Takalar, Maros), kelompok 2 (Spesimen P. sorghi asal Bengkayang dan Jerman), dan kelompok 3 (spesimen P. sorghi asal NTT dan AS)

Gambar 16 Variasi sangat tinggi (kotak merah) urutan nukleotida ke-3 DNA hasil pensejajaran spesimen Peronosclerospora sorghi (Ps) hasil survei dengan spesimen P. sorghi yang tersimpan di pangkalan data NCBI

Gambar 17 Kladogram spesimen Peronosclerospora philippinensis (Pp) hasil survei dan spesimen P. philippinensis yang tersimpan di pangkalan data NCBI menunjukkan 2 kelompok. Spesimen asal Maros terpisah dari kelompok spesimen lain yang tergabung dalam kelompok 1

Gambar 18 Variasi sangat tinggi (kotak merah) urutan nukleotida ke-3 DNA hasil pensejajaran spesimen Peronosclerospora philippinensis (Pp) hasil survei dengan spesimen P. philippinensis yang tersimpan di pangkalan data NCBI serta variasi spesimen Bitung dibanding spesimen lainnya (kotak hijau)

Pp_Minahasa-Rendah Pp_Bitung-Rendah Pp_Lampung-Rendah Pp_JF754979-Filipina Psa_JF754978-Taiwan

1.a

1.b

Pp_Takalar-Rendah

1

2

Pp_Maros-Rendah 38 65 24 26

45 Metode analisis yang sama dengan P. maydis, dilakukan juga untuk spesimen P. sorghi dan P. philippinensis. Analisis filogeni sikuen DNA spesimen P. sorghi hasil survei (selanjutnya disebut spesimen P. sorghi Indonesia) membagi spesimen menjadi 3 kelompok. Kelompok 1 terdiri atas spesimen P. sorghi Indonesia asal Bogor, Malang, Takalar, dan Maros. Selanjutnya kelompok 2 terdiri atas spesimen Indonesia asal Bengkayang dan spesimen P. sorghi asal Jerman. Kladogram spesimen P. sorghi menunjukkan single linkage antara spesimen asal NTT dengan spesimen asal AS (Gambar 15). Spesimen Indonesia asal NTT terpisah dengan ke-2 kelompok lain membentuk kelompok sendiri bergabung dengan spesimen P. sorghi asal AS. Hal ini dapat digunakan sebagai data dukung usulan infra spesies P. sorghi asal NTT.

Hasil analisis sikuen DNA spesimen P. sorghi menunjukkan bahwa terdapat variasi sangat tinggi pada urutan nukleotida ke-1, 3, 61, 83, 99, 123, 145, 157, dan ke-159 (Gambar 15), namun tidak terdapat variasi diantara spesimen P. sorghi asal NTT dengan spesimen asal AS. Hal ini berbeda dengan hasil kladogram yang telah dibuat sebelumnya (Gambar 14).

Analisis filogeni sikuen DNA spesimen P. philippinensis hasil survei dengan spesimen P. philippinensis yang tersimpan di pangkalan data NCBI membagi spesimen menjadi 2 kelompok. Spesimen P. philippinensis asal Maros, Sulawesi Selatan terpisah dengan kelompok 1, membentuk kelompok tersendiri (kelompok 2). Spesimen P. philippinensis Indonesia (Lampung, Minahasa, Bitung) bergabung dengan spesimen asal Laguna, Filipina dan spesimen P. sacchari asal Taiwan mebentuk sub kelompok 1a, namun spesimen Indonesia asal Takalar terpisah membentuk sub kelompok tersendiri yakni kelompok 1b. Analisis pensejajaran nukleotida DNA seluruh spesimen P. philippinensis membuktikan adanya variasi yang sangat tinggi pada nukleotida urutan ke-40, 41, 45, dan 47 (Gambar 16).

Pensejajaran sikuen asam amino sebagian gen COXII spesimen asal Indonesia dan spesimen P. maydis dan P. sorghi yang tersedia di pangkalan data NCBI menggunakan metode Neighbour Joining (NJ). Metode NJ merupakan metode paling sederhana dalam konstruksi kladogram (Saitou dan Nei 2009). Hasil pensejajaran sikuen asam amino spesimen P. maydis dan P. sorghi Indonesia dengan spesimen yang ada di pangkalan data NCBI menghasilkan beberapa daerah dengan konservasi tinggi. Konservasi tinggi untuk spesimen P. maydis yaitu GFMPIVIEAI dan LENYLNWLKNKTDI. Selanjutnya sikuen asam amino spesimen P. sorghi berkonservasi tinggi yaitu ATPVMEGIINFHHDLMFFLIIITVFVCWMLFKVIIILFNERKNKTPSTTV. Hasil pensejajaran tersebut juga menunjukkan area dengan variasi asam amino yang sangat tinggi, yaitu pada urutan asam amino ke-1 sampai dengan ke-18 (Gambar 19).

Gambar 19 Area konservasi (kotak kuning) dan variasi (tanda panah berwarna merah), hasil pensejajaran asam amino spesimen Peronosclerospora spp. asal Indonesia dengan spesimen P. maydis (A) dan P. sorghi (B) yang terdeposit di NCBI menggunakan perangkat lunak Clustal Omega dan Jalview version 2

47 Pembahasan

Penggunaan daerah COXI, COXII, dan ITS sebagai material genetik untuk identifikasi pseudo fungi anggota Oomycota telah intensif dipelajari. Bahkan daerah COXI sejak beberapa tahun terakhir diputuskan sebagai identitas DNA barcoding fungi/ fungal like organism (Robideau et al. 2011). Ke-3 daerah tersebut sangat bermanfaat digunakan dalam identifikasi di tingkat spesies, namun kurang memadai apabila diaplikasikan di tingkat subspesies (Salati et al. 2012). Hasil studi lebih dalam tentang keragaman genetik berbasis gen COX dan ITS oleh Martin dan Tooley (2003) menunjukkan bahwa analisis keragaman menggunakan gen COX lebih efisien dibanding ITS. Hasil pohon kekerabatan berbasis ITS akan menunjukkan hasil yang lebih kompleks dan sekuen yang non- orthologous, sehingga tidak dapat diaplikasikan untuk analisis keragaman genetik tingkat spesies dengan perbedaan biologi yang belum diketahui. Penggunaan ITS untuk analisis kladogram pada spesies anggota Oomycota lain, antara lain Phytophthora, mempunyai kelebihan dibanding gen COXII, yakni mampu membedakan antara spesies Phytophthora yang berpapila dan spesies tanpa papila (Villa et al. 2006). Gen lain yang biasa digunakan dalam analisis filogenik adalah cytochrome oxidase 1 dan beta tubulin.

Analisis DNA pada daerah COXI, COXII, dan ITS spesimen Peronosclerospora spp. asal 13 provinsi di Indonesia menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesimen asal luar negeri dengan daerah yang sama yang tersimpan di pangkalan data NCBI. Kemiripan yang tinggi dengan spesimen luar negeri ditengarai adanya lalu lintas benih yang tinggi pada dekade terakhir. Menurut Bahtiar et al. (2007), importasi benih jagung dari beberapa negara produsen benih kurun waktu tiga tahun terakhir mengalami peningkatan sebesar 10,5% per tahun. Selanjutnya pseudo fungi penyebab bulai jagung diketahui dapat terbawa benih. Murray (2009) melakukan penilaian dalam rangka rencana contigency terhadap P. sorghi dan P. philippinensis di Australia. Penilaian tersebut dibuat karena ke-2 spesies tersebut dapat terbawa benih jagung yang masuk ke Australia. P. sorghi juga telah dilaporkan masih dapat menunjukkan gejala infeksi pada benih jagung 10 sampai 12,8% yang diambil dari pasar benih di Nigeria, baik yang diberi perlakuan metalaksil atau tanpa perlakuan benih (Adenle dan Cardwell 2000).

Laporan lebih lengkap oleh White (2002) menyebutkan bahwa beberapa spesies pseudo fungi penyebab bulai jagung merupakan cendawan terbawa benih (seedborne). Namun demikian hanya 3 spesies yakni P. sorghi, P. philipinensis, dan P. sacchari dilaporkan berada di bagian pericarp dan embrio benih jagung. Cendawan P. maydis belum diketahui keberadaan di bagian benih jagung. Walau demikian tiga spesies Peronosclerospora lainnya yakni P. spontanea, P. heteropogoni, dan P. miscanthi belum diketahui dapat terbawa benih. Beberapa laporan menyebutkan bahwa P. heteropogoni tidak menyebabkan infeksi yang serius pada jagung, namun oospora dijumpai melimpah pada tanaman heteropogon. Dua spesies lainnya belum pernah dijumpai oospora pada jaringan tanaman jagung (untuk P. spontanea) namun hanya dalam bentuk miselia, sedangkan P. miscanthi dijumpai pada infeksi buatan namun tidak infeksi secara alami.

Variasi ketinggian tempat ternyata berpengaruh pada keberadaan spesies penyebab bulai. Spesies yang berbeda antara kategori ketinggian rendah, sedang, dan tinggi dapat dilihat pada spesimen P. sorghi asal Minahasa dengan ketinggian rendah identik dengan spesimen Takalar dengan kategori ketinggian yang sama. Namun demikian keduanya bebeda dengan spesimen P. sorghi asal Bogor dan Malang dari ketinggian masing-masing sedang dan tinggi. Hal lain yang bervariasi dijumpai pada P. philippinensis, yaitu spesimen Maros, dan Bitung dari ketinggian rendah berada terpisah dengan spesimen asal Minahasa dan Lampung dengan kategori ketinggian yang sama.

Variabilitas genetik Peronosclerospora spp. di Indonesia pada tingkat molekuler cukup tinggi. Hal ini sesuai dengan hasil studi ini, yang menunjukkan variabilitas tinggi pada nukleotida dan asam amino. Studi variabilitas terdahulu menyebutkan bahwa hasil filogeni membentuk 3 klaster dan sesuai dengan morfologi konidia patogen penyebab bulai. Klaster tersebut adalah klaster A yang terdiri atas koleksi DNA patogen asal Kediri (Jawa Timur), Landak, dan Bengkayang (Kalimantan Barat), yang diidentifikasi sebagai P. maydis, klaster B

Dalam dokumen Keragaman Dan Pemetaan Penyebab Bulai Jagung Di 13 Provinsi Indonesia (Halaman 54-71)