BAB 4 METODE PENILITIAN
4.9 Cara Kerja
4.9.1 Persiapan Hewan Coba
a. Memilih 24 ekor tikus wistar jantan usia diantara 2-3 bulan dengan berat badan 150-250 g.
b. Tikus wistar dibagi menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 7ekor tikus wistar.
4.9.2 Pembuatan gel dari ekstrak daun kelor
Pembuatan gel dari ekstrak daun kelor, terdiri dari 3 tahap yaitu: 1. Persiapan Sampel
Daun kelor diambil dari perkebunan Agrowisata Indomas, Menganti, Gresik. Sampel berupa daun kelor, dikumpulkan, dicuci dan dikeringkan dengan temperatur ruang selama 7 hari. Pengeringan bertujuan agar mendapatkan berat tetap dari daun kelor sesuai berat yang digunakan untuk ekstrak. Sampel yang sudah kering dihancurkan menggunakan blender.
2. Proses Ekstraksi Daun Kelor
Serbuk kering daun kelor, diekstraksi menggunakan alat ekstraktor ditambah ethanol 96% dengan perbandingan 1:1. Ekstrak tersebut dimasukkan dalam rotary flash evaporator (rotavapour) selama 24 jam sehingga diperoleh filtrat jernihnya. Ekstrak yang terkonsentrasi dievaporasi untuk proses pengeringan di dalam vacuum oven pada temperatur 50-60oC sampai tercapai
kandungan ethanol yang minimal. 1kg daun kelor + 1liter ethanol kemudian diuapkan sehingga dapat diperoleh 20-30gr residu ekstrak daun kelor cair berwarna kehijauan.
3. Pembuatan Sediaan Gel
Pada penelitian ini ekstrak daun kelor dibuat dalam bentuk sediaan gel. Ekstrak akan lebih mudah diaplikasikan dalam bentuk sediaan gel pada luka pasca pencabutan gigi karena sifatnya yang semisolid, lembut dan elastik. Sediaan gel mempermudah substansi ekstrak dapat mudah masuk dalam soket (Khoswanto, 2010). Bahan gel yang akan digunakan adalah CMC Na 3% sebanyak 3gr, dimasukkan dalam gelas kemudian ditambah 100ml aquades diaduk selama 6 jam sehingga diperoleh gel sempurna 3%. Ekstrak daun kelor 15% dimasukkan ke dalam gelas kemudian ditambahkan 85ml gel diaduk selama 30 menit, sehingga diperoleh gel ekstrak daun kelor.
4.9.3 Proses Pencabutan Gigi Tikus Wistar
1.Tikus wistar dilakukan tindakan pembiusan umum dengan menggunakan klorofom secara inhalasi dengan dosis letal
2.Tikus wistar dilakukan pencabutan gigi insisif kiri rahang bawah dengan menggunakan tang.
3.Setelah dilakukan pencabutan, dilakukan irigasi dengan menggunakan aquadest untuk menghilangkan debris atau sisa-sisa pasca pencabutan gigi.
4.9.4 Pembuatan Sediaan Histologis 4.9.4.1 Fiksasi Jaringan
Setelah tikus wistar tidak bernyawa lagi, proses selanjutnya adalah melakukan pengambilan jaringan tubuh yang diinginkan, yaitu pemotongan mandibula tikus wistar dengan melakukan insisi dari sudut mulut ke arah posterior sampai rahang bawah terlepas dari tengkorak, selanjutnya dimasukkan kedalam larutan fiksasi. Larutan fiksasi yang digunakan adalah larutan formalin 10%, untuk mencegah perubahan jaringan post mortem agar tidak membusuk, mencegah autolisis jaringan dan mengeraskan jaringan.
4.9.4.2 Pengolahan Jaringan
Pengolahan dilakukan dengan alat autotechnicom selama 24 jam dengan tahapan:
a. Dehidrasi
Dehidrasi merupakan proses menarik air dari dalam jaringan dengan menggunakan alkohol secara bertahap sehingga jaringan dapat diisi parafin untuk membuat blok preparat. Caranya dengan memasukkan jaringan kedalam alkohol secara berurutan mulai dari konsentrasi :
a) Alkohol 70% selama 15 menit. b) Alkohol 80% selama 15 menit. c) Alkohol 90% selama 15 menit. d) Alkohol 95% selama 15menit. e) Alkohol 99% selama 15 menit. f) Alkohol 100% selama 15 menit.
b. Clearing
Clearing atau menjernihkan jaringan, yaitu tahap untuk mengeluarkan alkohol dari jaringan dan menggantinya dengan suatu larutan yang dapat berikatan dengan parafin. Jaringan tidak dapat langsung dimasukkan ke dalam parafin karena alkohol dan parafin tidak bisa saling melarutkan, larutan yang digunakan adalah xylol. Setelah jaringan dikeluarkan dari cairan dehidrasi, jaringan dimasukkan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing dilakukan selama 30 menit. Jaringan akan menjadi bening.
c. Impregnasi/Embedding
Merupakan proses untuk mengeluarkan cairan (clearing agent) dari jaringan dan diganti dengan parafin. Pada tahap ini jaringan harus benar- benar bebas dari clearing agent karena cairan tersebut dapat mengkristal dan sewaktu dipotong dengan mikrotom akan menyebabkan jaringan mudah robek. Zat pembenam (bahan impregnasi) yang digunakan adalah parafin cair panas yang mempunyai temperatur rendah (melting temperature) kira-kira 560C. Jaringan kemudian direndam dalam parafin cair 1 dengan titik lebur 560C selama 21⁄2 jam, kemudian dimasukkan dalam parafin cair 2 selama 4 jam. Setelah itu jaringan siap dimasukkan dalam blok parafin.
d. Pengecoran (Blocking)
Dengan membuat potongan besi berbentuk huruf L (Leuckhart) 2 tuah potongan besi disusun di atas lembaran logam hingga rapat dan membentuk ruang seperti kubus. Tuangkan parafin cair di bagian pinggir tempat pertemuan potongan besi agar tidak bocor. Selanjutnya parafin dituangkan ke dalam ruangan kubus.
e. Pemotongan (mounting)
Dilakukan dengan rotary microtome. Selama pemotongan, suhu blok diusahakan rendah yaitu 5-10oC, dengan mendinginkan blok dan pisau pemotong dengan air es agar sediaan tetap basah, sehingga blok dapat terpotong dengan baik. Blok yang mengandung jaringan lalu dipindahkan secara hati-hati menggunakan kuas ke dalam waterbath yang temperaturnya diatur 37- 400C dan biarkan beberapa saat hingga blok parafin tersebut mengembang.
Setelah blok parafin terkembang dengan baik, blok parafin tersebut ditempelkan pada kaca objek dengan cara memasukkan kaca objek itu ke dalam waterbath dan menggerakkannya ke arah blok parafin, dengan menggunakan kuas kemudian dilekatkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar blok parafin tidak terlipat.
Kaca objek yang berisi blok parafin diletakkan di atas hotplate/termoplate, dibiarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek di atas api sehingga blok parafin melekat erat di atas kaca objek.
f. Pengecatan jaringan
Jaringan yang telah dipotong diberi pewarnaan sehingga unsur jaringan menjadi dapat diamati dengan mikroskop. Kemudian, dilakukan pengecatan Hematoksilin Harris-Eosin (HE) dengan prosedur sebagai berikut:
1. Deparafinisasi, yang bertujuan menghilangkan parafin yang menempel pada irisan jaringan sehingga bahan cat dapat melekat. Dilakukan dengan memasukkan dalam larutan xylol.
3. Direndam dalam larutan Hematoksilin Harris selama 15 menit. 4. Dibilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat.
5. Dicelupkan dalam HNO3 secara cepat 3-10 x celup, kemudian dilakukan pengecekan diferensiasi warna di bawah mikroskop.
6. Dibilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat.
7. Dicelup sebanyak 3-5 kali dalam larutan amonium atau litium hingga potongan berwarna biru cerah.
8. Dicuci dalam air mengalir selama 10-20 menit. Bila pencucian tidak maksimal jaringan akan sulit diwarnai oleh Eosin.
9. Direndam dalam Eosin selama 15 detik - 2 menit.
10. Dilakukan dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan, masing-masing selama 2 menit.
11. Dimasukkan dalam larutan xylol 2x2 menit.
12. Ditutup dengan kaca penutup dan preparat siap untuk dilakukan pemeriksaan di bawah mikroskop cahaya.