BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Pembuatan Medium Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Agar (PDA)
Sebanyak 300 g kentang yang telah dicuci, dipotong-potong, direbus dalam 500 ml akuades selama 1 jam kemudian disaring dengan kain kassa 4 lapis. Filtrat yang diperoleh ditambah dengan akuades hingga mencapai volume 1 liter, kemudian ditambah 20 g dekstrosa sambil dipanaskan dan diaduk hingga larut. Medium PDB yang telah larut sempurna dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Medium PDB steril yang telah dingin ditambahkan 1 ml asam laktat 10% untuk menghambat pertumbuhan bakteri, kemudian disimpan pada suhu kamar selama 1 hari (Bridson, 1998). Medium PDA dibuat dengan cara yang sama dengan PDB, tetapi diberi tambahan agar 1,5 % dan dimasukkan ke dalam sejumlah tabung reaksi sebelum sterilisasi. Medium PDA dibiarkan membeku dalam keadaan miring dan disimpan pada suhu kamar sebelum digunakan (Bridson, 1998).
3.3.2. Pembuatan Medium Ekstrak Ubi Jalar
Sebanyak 300 g ubi jalar yang telah dicuci, dipotong-dipotong berbentuk dadu, direbus selama 1 jam dalam 500 ml akuades kemudian disaring dengan kain kassa 4 lapis. Lalu filtrat rebusan yang diperoleh ditambahkan dengan akuades sampai mencapai volume 1 liter dan dimasukkan dalam labu Erlenmeyer. Ekstrak disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit
(Sugoro dan Mellawati, 2005). Ekstrak ubi jalar 18 L dibuat dari 5,4 kg ubi jalar dengan cara yang sama.
3.3.3. Persiapan Kultur Inokulum
Isolat khamir R1 dan R2 diperoleh dari koleksi Laboratorium Kelompok Kesehatan dan Reproduksi Ternak PATIR BATAN. Isolat khamir dalam medium PDA miring berumur 1 hari diinokulasi sebanyak tiga ose ke dalam 30 ml medium PDB kemudian diinkubasi selama satu hari sambil dikocok dengan shaker pada kecepatan 120 rpm. Kepadatan kultur berumur 24 jam dihitung dengan metode Neubauer untuk membuat inokulum ekstrak ubi jalar 30 ml berkepadatan 106 sel/ml.
Jumlah sel dihitung setelah dilakukan pengenceran 101-103, misalnya 0,1 ml inokulum atau suspensi sel ditambah dengan 0,9 ml akuades steril untuk pengenceran 101. Tiap pengenceran dihitung dengan kamar hitung Neubauer (haemacytometer). Jumlah sel dihitung pada tiga kamar, kemudian dirata-ratakan.
Cara yang sama dilakukan untuk membuat kultur inokulum ekstrak ubi jalar 300 ml dan 1000 ml. Inokulum untuk membuat kultur 300 ml berasal dari kultur 30 ml berumur 1 hari, sedangkan inokulum untuk membuat kultur 1000 ml berasal dari kultur 300 ml berumur 1 hari, yang masing-masing sebesar 10 % (v/v) dengan kepadatan 106 sel/ml. Inokulum 1 L inilah yang akan digunakan sebagai kultur inokulum untuk fermentasi pada fermentor air- lift skala 18L. Inokulum 1 L berumur 2 hari inilah yang akan digunakan sebagai kultur inokulum untuk fermentasi pada fermentor air- lift skala 18L. Inokulum 1 L untuk R1 dibuat sebanyak 6 kali untuk diinokulasi ke dalam 6 medium ekstrak ubi jalar 18 L yang
terdiri atas 3 perlakuan yang berbeda dengan 2 kali ulangan, begitu pula inokulum 1 L untuk R2.
3.3.4. Optimasi Penambahan Kadar Molase pada Fermentor Air-Lift 18 L
Kultur inokulum R1 atau R2 dari inokulum 1 L diinokulasi sebanyak 10 % v/v (106 sel/ml) ke dalam 2 medium perlakuan dan 1 medium tanpa perlakuan (kontrol) yang masing-masing bervolume 18 L dalam fermentor air-lift. Kedua medium perlakuan mengandung molase dengan kadar yang berbeda, sedangkan medium kontrol tidak mengandung molase atau hanya mengandung ekstrak ubi jalar.
Tabel 3.1. Perlakuan pada Fermentor air-lift 18 L
Perlakuan Penambahan kadar molase pada R1 Penambahan kadar molase pada R2
1 0 % 0 %
2 0,5 % 0,5 %
3 1 % 1 %
Proses inkubasi pada fermentor air-lift 18 liter berlangsung selama 8 hari pada suhu ruang dengan kecepatan aerasi sebesar 500 ml/menit. Selama proses fermentasi berlangsung, pengambilan sampel dilakukan pada hari ke 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8. Sampel diambil dengan menggunakan pipet serologis sebanyak 15 ml. Sampel sebanyak 5 ml digunakan untuk pengukuran pH. Sampel sebanyak 10 ml disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm, peletnya digunakan untuk pengukuran berat kering biomassa, sedangkan supernatannya digunakan untuk pengukuran kadar glukosa dan kadar protein.
3.3.5. Pengukuran Kadar Glukosa dalam Medium
Pengukuran kadar glukosa dengan metode Somogyi-Nelson dilakukan dengan tahapan prosedur berikut ini.
1. Pembuatan reagen Nelson
Reagen Nelson A: Sebanyak 12,5 g Na karbonat anhidrat, 12,5 g Rochelle, 10 g Na bikarbonat dan 100 g Na sulfat anhidrat dilarutkan dalam 100 ml akuades selanjutnya diencerkan hingga 500 ml.
Reagen Nelson B: Sebanyak 7,5 g CuSO4.H2O dilarutkan dalam 50 ml akuades ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat.
Reagen Nelson dibuat dengan cara mencampurkan Reagen Nelson A dan Nelson B dengan perbandingan 25:1. Pencampuran dilakukan pada saat akan dipergunakan.
2. Pembuatan larutan Arsenomolibdat
Larutan I: Sebanyak 25 g ammoniumolibdat dilarutkan dalam 450 ml akuades, lalu ditambah 25 ml asam sulfat pekat.
Larutan II: Sebanyak 3 g Na2H2SO4.7H2O dilarutkan dalam 25 ml akuades. Larutan II dituangkan ke dalam larutan I dan disimpan dalam botol berwarna coklat, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. 3. Pembuatan glukosa standar
Sebanyak 100 mg glukosa anhidrat dilarutkan dalam 100 ml akuades, kemudian diakukan pengenceran seperti pada Tabel 3.2.
Tabel 3.2. Pembuatan Larutan Glukosa Standar
No Tabung 1 2 3 4 5 6 7
Larutan standar (ml) 0,00 0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00
Akuades (ml) 1,00 0,99 0,95 0,90 0,75 0,50 0,00
Kadar glukosa (mg/ml) 0,00 0,01 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00
4. Penentuan kadar glukosa
Sebanyak 1 ml sampel atau larutan glukosa standar ditambah 1 ml reagen Nelson, kemudian dipanaskan pada penangas air 100°C selama 20 menit, setelah larutan didinginkan dalam gelas piala yang berisi air dingin sampai tabung mencapai suhu 25°C, ditambah 1 ml reagen arsenomolibdat, dan dikocok sampai endapan Cu2O yang ada larut kembali. Setelah semua larut, ditambahkan 7 ml akuades, dikocok sampai homogen dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Hasil pengukuran absorbansi larutan glukosa standar dibuat menjadi kurva standar glukosa. Kadar glukosa sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorbansi sampel dalam persamaan yang diperoleh dari kurva standar glukosa.
Laju konsumsi glukosa dihitung berdasarkan perubahan kadar glukosa medium perharinya.
Keterangan: Kn = laju konsumsi glukosa pada hari ke-n (g/l/hari) Gn = kadar glukosa pada hari ke-n
t = waktu (hari)
Kn = (Gn-1) – (Gn) t
3.3.6. Pengukuran Kadar Protein dalam Medium
Pengukuran kadar protein dapat dilakukan secara tidak langsung melalui pengukuran kadar nitrogen total dengan Metode Kjeldahl (Meyers, 2000). Supernatan hasil produksi biomassa diambil secukupnya agar amoniak yang keluar akan ternetralisir oleh 10 ml 0,04 N asam klorida, lalu ditempatkan dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambah 1 gram campuran katalis (1 gr selenium, 1 gr kuprisulfat pentahidrat dan 20 gr kalium sulfat; semuanya digerus halus dan dicampur dengan baik). Sebanyak 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan ke dalam labu tersebut, kemudian dipanaskan sampai bening. Campuran didiamkan sampai dingin, lalu dilarutkan dengan 10 ml akuades. Selanjutnya campuran ditempatkan dalam labu destilasi, ditambahkan 25 ml HCl 0,04 N, indikator PP (phenolphthalein) 3 tetes dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan destilasi. Hasil destilasi (destilat) dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai berubah warna dari jernih menjadi merah muda.
Selanjutnya persentase kadar nitrogen dapat ditentukan melalui penghitungan berikut ini:
Keterangan: V1 = vol HCl 0,04 N yang dipakai dalam penentuan V1 = vol HCl 0,04 N yang dipakai dalam blangko W = berat sampel (mg)
Untuk memperoleh persentase kadar protein, nilai persen nitrogen dikalikan suatu faktor konversi 6,25, yaitu faktor konversi protein yang rata-rata
% N = 100 (V1-V2) x 0,5603 W
mengandung 16 % nitrogen (Meyers, 2000).
Keterangan: % P = Persentase kadar protein % N = Persentase kadar nitrogen
3.3.7. Pengukuran Biomassa Khamir
Tabung sentrifus dikeringkan pada suhu 80ºC selama 24 jam, didinginkan, dan ditimbang. Sebanyak 10 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang diperoleh dikeringkan dalam oven pada suhu 80°C selama 48 jam. Tabung berisi pelet kering dimasukkan ke dalam desikator selama 1 jam kemudian ditimbang bobot akhirnya. Biomassa khamir dihitung berdasarkan selisih antara bobot awal dan bobot akhir tabung (Rahman, 1992).