BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.4. Cara Kerja
3.4.1. Bagan Kerja Penelitian
Ekstraksi Ekstraksi etil asetat 3X 3X metanol
Gambar 6. Skema Bagan Kerja Penelitian.
Isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.)
Peremajaan di media PDA
Fermentasi cair (Still culture) di media PDB
Hasil fermentasi
Filtrat Biomassa
Ekstrak etil asetat
Filtrat Biomassa Ekstrak metanol
Ekstrak kering
Ekstrak kering
Analisis Aktivitas Antioksidan
Autografi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Spektrofotometer UV-Vis Pengamatan makroskopis dan mikroskopis
3.4.2. Peremajaan Kapang Endofit
Isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari masing-masing morphotype
ditanam pada cawan petri yang berisi media Potato Dextrose Agar (PDA) secara duplo dan disimpan selama 7 hari pada suhu ruang. Isolat yang diremajakan tersebut disimpan sebagai kultur stok dan working culture.
3.4.3. Pengamatan Kapang Endofit
Pengamatan secara makroskopis dilakukkan dengan mengamati warna koloni kapang, bentuk area miselium kapang, bentuk tepi miselium kapang, mengamati ada atau tidaknya bintik jingga dan bintik hitam serta kapang yang terdapat pada cawan didokumentasikan menggunakan kamera digital.
Pengamatan secara mikroskopis menggunakan mikroskop stereo dan mikroskop cahaya. Konidia diambil menggunakan ose secara aseptis. Bagian permukaan koloni diambil dan diletakan diatas gelas objek yang telah ditetesi
shear’s diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 sampai 1000
kali menggunakan minyak imersi.
3.4.4. Fermentasi Cair Kapang Endofit
Isolat tunggal yang telah diremajakan dari cawan petri diinokulasikan ke dalam medium fermentasi cair yaitu Potato Dextrose Broth (PDB). Medium PDB yang digunakan yaitu sebanyak 200 ml untuk setiap isolat. Pembuatan medium dilakukan dengan menimbang medium lalu dilarutkan dengan menggunakan akuades. Medium dilarutkan dan dipanaskan diatas hot plate menggunakan
21
kedalam botol fermentasi yang ditutup sumbat dan disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.
Inokulasi dilakukan dengan mengambil 3 cetakan dari isolat kapang yang ada didalam PDA cawan dengan sedotan steril lalu dimasukkan kedalam medium PDB secara aseptis. Medium PDB tersebut diinkubasikan selama 21 hari pada suhu ruang (27°C) tanpa pengocokan. Setelah 21 hari, hasil fermentasi dipisahkan antara filtrat dan biomassa dengan cara disaring untuk uji antioksidan.
3.4.5. Ekstraksi Hasil Fermentasi dengan Pelarut Organik
Hasil fermentasi yang telah disaring dan dipisahkan antara filtrat dan biomassa, kemudian diekstraksi cair cair pada filtrat dengan penambahan etil asetat sedangkan ekstraksi cair cair pada biomassa menggunakan metanol.
a) Ekstraksi cair cair terhadap filtrat (ekstrak filtrat)
Filtrat diberi etil asetat sebanyak 100 ml (v/v). Kemudian dikocok dalam corong terpisah, dan didiamkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan atas (lapisan organik) merupakan ekstrak etil asetat yang akan melarutkan senyawa-senyawa organik yang ada pada ekstrak kapang lalu fraksi ini dipisahkan. Lapisan bawah merupakan fraksi air lalu fraksi tersebut ditambahkan etil asetat baru kemudian dikocok dengan corong pisah dan didiamkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan (pengocokan fraksi air dengan etil asetat dilakukkan sebanyak tiga kali) dan hanya lapisan atas saja yang diambil. Fraksi etil asetat yang diperoleh disatukan dan dikeringkan menggunakan rotary evaporator suhu 40°C sampai didapatkan ekstrak kering untuk uji antioksidan.
b) Ekstraksi cair cair terhadap biomassa (ekstrak biomassa)
Biomassa hasil saringan diekstraksi dengan metanol sebanyak 100 ml (v/v) dan dihaluskan menggunakan mortar sampai isolat kapang halus kemudian dimaserasi dan di shaker selama 24 jam. Kemudian disaring untuk diambil filtratnya sedangkan biomassanya (ampas) diberi metanol baru (maserasi dilakukan berulang sebanyak tiga kali). Hasil ekstraksi yang diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator suhu 40°C sehingga diperoleh ekstrak pekat untuk dilakukkan uji antioksidan.
3.4.6. Uji Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Hasil Fermentasi
3.4.6.1. Metode DPPH Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak pekat yang didapatkan dari biomassa dan filtrat sebanyak satu mg dilarutkan dengan 10 ml metanol lalu di vortex sampai larut, setelah itu sampel ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) begitu juga dengan pembuatan vitamin C sebagai kontrol. Pelat KLT dimasukkan ke dalam chamber
yang berisi fase gerak etil asetat: metanol : air dengan perbandingan (100:13,5:10) ml. Pelat yang telah mencapai garis akhir dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Kromatogram disemprot menggunakan larutan DPPH (Tamat et al., 2007). Larutan stok DPPH disimpan kedalam botol gelap (pembuatan larutan DPPH selalu baru untuk setiap pengujian) lalu diamkan selama 20 menit (Saputri, 2013). Intensitas warna DPPH akan berubah dari warna ungu menjadi kuning yang disebabkan oleh elektron yang berasal dari senyawa antioksidan (Molyneux, 2004). Menurut Listiandiani (2011), bercak pada KLT diamati di bawah sinar UV
23
pada λ 254 nm dan λ 366 nm. Bercak pada pelat diamati dan dihitung nilai Rf (retardation factor) dengan rumus :
3.4.6.2. Metode DPPH Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Pengujian dilanjutkan dengan uji persentasi yaitu untuk menentukan kadar antioksidan menggunakan spektrofotometer dengan cara ekstrak dilarutkan didalam metanol dan dibuat stok untuk pengenceran. Seri pengenceran dibuat dari larutan stok sebanyak lima variasi konsentrasi. Ekstrak kapang dari berbagai variasi konsentrasi sebanyak 2 ml ditambahkan 2 ml DPPH 0,002% didalam metanol. Ekstrak didiamkan selama 30 menit di dalam botol gelap (Bendra, 2012). Larutan stok DPPH disimpan kedalam botol gelap (pembuatan larutan ini selalu baru untuk setiap pengujian) lalu diamkan selama 20 menit (Azizah, 2013). Pembanding (kontrol) yang digunakan adalah larutan vitamin C dalam metanol dengan berbagai variasi konsentrasi. Absorbansi dari kedua larutan tersebut diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ maksimum 517 nm. Pengukuran absorbansi dilakukan 2 kali pengulangan. Aktivitas antioksidan diukur dari penurunan absorbansi larutan DPPH akibat penambahan ekstrak hasil fermentasi (Molyneux, 2004).
3.4.7. Analisis Ekstraksi Metabolit Sekunder dengan GC-MS
Ekstrak kapang endofit yang memiliki nilai IC50 yang tertinggi secara
untuk dianalisis menggunakan GC-MS Shimadzu QP 2010 untuk mengetahui komponen senyawa yang terdapat pada kedua ekstrak tersebut. Sampel sebanyak 1 µl diinjeksikan ke dalam GC-MS yang dioperasikan menggunakan kolom kaca panjang 25 m, diameter 0,25 mm dan ketebalan 0,25 µl dengan fase diam CP-Sil 5 CB dengan temperatur 10oC/menit, gas pembawa helium bertekanan 12 kPa, total laju 30 mL/menit dan split rasio sebesar 1:50 (Sastroamidjojo, 2001).