BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
2.3.4 Instrumen KCKT
2.3.4.4 Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung dari instrumen HPLC karena proses pemisahan terjadi di sini. Kolom umumnya terbuat dari 316-grade stainless steel yang relatif tahan karat dan dikemas dengan fase diam tertentu. Ukuran kolom untuk tujuan analitik berkisar antara panjang 10 hingga 25 cm dan diameter dalam 3 hingga 9 mm (Brown dan DeAntonis, 1997).
2.3.4.5 Detektor (Detector)
Detektor dapat dibagi ke dalam dua kategori yakni bulk property detector (detektor universal) dan solute property detector (detektor spesifik). Jika detektor mampu mengukur sifat baik dari solut maupun fase gerak, detektor demikian merupakan bulk property detector. Sedangkan detektor yang hanya mampu mengukur sifat solut dinamakan solute property detector (Brown dan DeAntonis, 1997). Karakteristik detektor yang baik adalah sensitif, batas deteksi rendah, respon yang linier, mampu mendeteksi solut secara universal, tidak destruktif, mudah dioperasikan, memiliki dead volume yang kecil dan tidak sensitif terhadap perubahan suhu serta kecepatan fase gerak (Hamilton dan Sewell, 1977). Beberapa detektor yang paling sering digunakan dalam KCKT adalah detektor spektrofotometri UV-Vis, photodiode-array (PDA), fluoresensi, indeks bias dan detektor elektrokimia (Rohman, 2007).
2.3.4.6 Perekam (Recorder)
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan menangkap sinyal elektronik dari detektor dan memplotkannya ke dalam kromatogram sehingga dapat dievaluasi oleh analis (Brown dan DeAntonis, 1997).
2.4 Validasi Metode
Organisasi standarisasi internasional (ISO/The International Organization
for Standarization) mendefinisikan validasi sebagai suatu perngesahan dengan
cara pemeriksaan dan penetapan bukti-bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk tujuan spesifik yang diinginkan telah dipenuhi (MacNeil, et.al., 2000). FDA (Food and Drugs Administration) dalam publikasinya yang terbaru, Guidance for
Industry on Analytical Procedures and Methods Validation, menyatakan bahwa
validasi metode adalah suatu proses yang menunjukkan bahwa prosedur analitik telah sesuai dengan penggunaan yang dikehendaki. Proses validasi metode untuk prosedur analitik dimulai dengan pengumpulan data validasi oleh pelaksana guna mendukung prosedur analitiknya (Bliesner, 2006).
Validasi merupakan persyaratan mendasar yang diperlukan untuk menjamin kualitas dan reabilitas hasil dari semua aplikasi analitik (Ermer, 2005). Hasil validasi metode dapat digunakan untuk memutuskan kualitas, reabilitas dan konsistensi dari hasil analitik. Hal ini merupakan bagian tak terpisahkan dari suatu praktik analitik yang bagus (Huber, 2007). Menurut Farmakope Amerika Serikat (USP/United States Pharmacopeia) Edisi Ketigapuluh, ada 8 karakteristik utama yang digunakan dalam validasi metode, yakni akurasi/kecermatan, presisi/keseksamaan, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang dan kekuatan/ketahanan. Semua karakteristik itu diringkas dalam tabel 1.
Tabel 1. Delapan Karakterisitk Utama yang Digunakan dalam Validasi Metode
Analitik
Karakteristik Pengertian
Akurasi/Kecermatan Kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode analitik dengan nilai sebenarnya.
Presisi/Keseksamaan Ukuran keterulangan metode analitik, termasuk di antaranya kemampuan instrumen dalam memberikan hasil analitik yang reprodusibel.
Spesifisitas Kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan komponen matriks.
Batas deteksi Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.
Batas kuantitasi Konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Linieritas Kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan.
Rentang/Kisaran Konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analitik menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang cukup.
Kekuatan/Ketahanan Kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil.
2.4.1 Akurasi/Kecermatan
Akurasi dapat ditentukan dengan dua metode, yakni spiked-placebo
metode simulasi, analit murni ditambahkan (spiked) ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit hasil analisis dibandingkan dengan jumlah analit teoritis yang diharapkan. Jika plasebo tidak memungkinkan untuk disiapkan, maka sejumlah analit yang telah diketahui konsentrasinya dapat ditambahkan langsung ke dalam sediaan farmasi otentik. Metode ini dinamakan metode standard addition method atau metode penambahan baku. Jumlah keseluruhan analit kemudian diukur dan dibandingkan dengan jumlah teoritis, yaitu jumlah analit yang murni berasal dari sediaan farmasi otentik tersebut, ditambah dengan jumlah analit yg di-spiked ke dalam sediaan. Akurasi kemudian dinyatakan dalam persen perolehan kembail (%Recovery). %Recovery ditentukan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dari analisis dengan hasil sebenarnya yang dihitung secara teoritis. Hal yang penting untuk diperhatikan adalah metode kuantitasi yang digunakan dalam penentuan akurasi harus sama dengan metode kuantitasi yang digunakan untuk menganalisis sampel dalam penelitian (Ermer, 2005; Harmita, 2004; Vanderwielen dan Hardwidge, 1982).
2.4.2 Presisi/Keseksamaan
Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku relatif dari jumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Rohman, 2007). Berdasarkan rekomendasi ICH (the International Conference on the Harmonisation), karakteristik presisi dilakukan pada 3 tingkatan, yakni keterulangan (repeatability), presisi antara (intermediate precision) dan reprodusibilitas (reproducibility). Keterulangan dilakukan dengan cara menganalisis sampel yang sama oleh analis yang sama menggunakan instrumen yang sama dalam periode
waktu singkat. Presisi antara dikerjakan oleh analis yang berbeda. Sedangkan reprodusibilitas dikerjakan oleh analis yang berbeda dan di laboratorium yang berbeda (Épshtein, 2004).
2.4.3 Spesifisitas
Dalam prosedur analitik yang spesifik, pengukuran yang digunakan untuk penentuan suatu senyawa tidak dipengaruhi oleh adanya material lain (Vanderwielen dan Hardwidge, 1982). Secara umum, spesifisitas dapat ditunjukkan oleh pendekatan secara langsung maupun tidak langsung. Pendekatan langsung dapat ditunjukkan oleh minimalnya gangguan oleh senyawa lain terhadap hasil analisis misalnya mendapatkan hasil yang sama dengan atau tanpa senyawa pengganggu, resolusi kromatografik yang bagus dan kemurnian puncak (peak purity). Pendekatan tidak langsung adalah lewat pengamatan karakteristik akurasi dari metode tersebut. Bila akurasi metode telah dapat diterima (acceptable) dan valid, maka metode tersebut otomatis telah masuk kriteria sebagai metode yang spesifik (Ermer, 2005).