Bab 8 Teknik Isolasi
8.4. Komatografi Partisi Cair-cair
Dalam kromatografi partisi, fase stasioner yang digunakan berupa cairan. Fase mobilnya dapat berupa cairan seperti pada High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) atau berupa gas, yaitu pada Gas Liquid Cromatography (GLC). Karena baik fase stasioner maupun fase mobil berupa cairan, maka biasa digunakan Liquid-liquid Partitian Chromatography.
Kromatografi cair lebih dikenal dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) dan lebih dari 75% dari pemakaian HPLC menggunakan fasa padat ODS (Oktadesil Sifane) atau C-18.
Sedangkan fasa cair sebagai pelarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien, senyawa non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan
152 |Page
membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan harus dilakukan dengan mengubah kepolaran pelarut yang digunakan. Efisiensi penggunaan HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam pemakaian HPLC.
Sebelum diperkenalkannya HPLC, kromatografi cairan tidak sepopuler kromatografi gas. Dengan makin meluasnya penggunaan teknik kromatografi untuk analisis senyawa-senyawa organik, termasuk bahan makanan, maka penggunaan HPLC menjadi makin banyak. Makin populernya penggunaan HPLC disebabkan teknik ini mempunyai beberapa keunggulan seperti:
1. HPLC dapat menangani senyawa-senyawa yang stabilitasnya terhadap suhu terbatas, begitu juga volatilitasnya bila tanpa menggunakan derivatisasi. Sebagai contoh misalnya analisis beberapa jenis gula, dapat dikerjakan dengan HPLC tanpa proses derivatisasi dulu.
2. HPLC mampu memisahkan senyawa yang sangat serupa dengan resolusi yang baik. Meskipun demikian kemajuan teknik kromatografi yang lain juga dapat memperbaiki hasilnya, misalnya dengan penggunaan kolom kapiler pada kromatografi gas cairan. Selain itu juga pada TLC, yang dengan menggunakan plat yang kualitasnya baik dapat juga menghasilkan resolusi yang memuaskan.
3. Waktu pemisahan dengan HPLC biasanya singkat, sering hanya dalam waktu 5-10 menit, bahkan kadang-kadang kurang dari 5 menit untuk senyawa yang sederhana. Sudah barang tentu harus diingat bahwa itu adalah analisis untuk satu sampel. Sedangkan dengan TLC sampel yang lebih
Page | 153 banyak dapat dipisahkan sekaligus, seperti analisis mikotoksil
dari berbagai biji-bijian.
4. HPLC dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan baik dan dengan presisi yang tinggi, dengan koefisien variasi dapat kurang dari 1%. Untuk sampel bahan makanan, biasanya koefisien variasinya lebih tinggi disebabkan preparasinya yang lebih sukar, misalnya ekstraksi dan proses pemurnian yang lain.
5. HPLC juga merupakan teknik analisis yang peka. Hal ini sangat penting untuk analisis mikotoksin seperti aflatoksin Namun demikian, mungkin analisis senyawa lain tidak memerlukan kepekaan seperti itu, misalnya anaisis gula.
8.4.1 Susunan Peralatan
Susunan alat-alat yang dipakai untuk HPLC tidak banyak berbeda dengan kromatografi gas-cair, hanya disesuaikan dengan sifat khusus dari kromatografi cairan. Komponen utama alat yang dipakai ialah:
1) Reservoir Zat Pelarut
Zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis, yang penting dipehatikan ialah, bahwa tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut tersebut. Cara yang dipakai dapat bermacam-macam, misalnya dengan pemanasan, perlakuan vakum, atau dengan mengalirkan gas yang bersifat inert seperti helium.
154 |Page
2) Pompa
Pompa diperlukan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobil dengan kecepatan dan tekanan yang tetap. Gangguan pada pompa biasanya karena perawatan yang kurang teratur, yang disebabkan oleh gangguan pelarut yang tidak difiltrasi dengan baik, adanya elektrolit yang mengandung kadar klorida yang tinggi pada Ph yang rendah, dan terjadinya endapan dalam pompa. Tekanan yang diperlukan tergantung dari ukuran kolom dan viskositas dari pelarut.
3) Injector
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau digunakan katup injeksi, di mana sampel diinjeksikan ke dalam holding loop.
Injeksi langsung ke dalam kolom dapat dilakukan dengan syringe. Injeksi dengan syringe dapat dilakukan melalui septum atau tanpa septum. Dengan cara ini dapat diperoleh efisiensi pemisahan yang sangat tinggi.
4) Kolom
Ukuran kolom yang umum dipakai ialah dengan panjang 10-25 cm dan berdiameter 4,5-5,0 mm, yang diisi dengan fase stasioner berukuran rata-rata 5-10 μm, dam dibuat dari logam stainles steel.
Meskipun banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan konstan dengan memakai berbagai cara pemanasan. Sering diperlukan
Page | 155 suhu kolom yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk
mengatasi masalah daya laut solut yang dianalisis dan viskositas fase mobil yang agak tinggi.
5) Detektor
Untuk memenuhi semua persyaratan dalam mendeteksi suatu zat memang sukar. Namun sifat-sifat detektor yang diperlukan ialah: mempunyai sensitivitas yang tinggi, bersifat linear untuk jangka konsentrasi tertentu, dan dapat mendeteksi eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatogram. Detektor harus tidak terlalu peka terhadap perubahan berbagai parameter terutama suhu dan tekanan.
Beberapa detektor untuk HPLC diantaranya adalah:
a. Detektor Ultraviolet b. Detektor fluoresensi c. Detektor Konduktivitas d. Detektor Indeks Refraksi
e. Detektor FID (Flame Ionization Detector)
8.4.2 Derivatisasi
Banyak senyawa yang sukar omtuk dideteksi dengan detektor yang ada. Untuk mengatasi hal ini dan untuk mempermudah dideteksinya senyawa tersebut, maka proses derivatisasi menjadi sangat penting. Proses derivatisasi dapat dilakukan sebelum sampel diinjeksikan (pre-column derivatization) atau sesudah pemisahan dari kolom (post-column derivatization).
156 |Page
8.4.3 Elusi Gradien
Bila campuran dari senyawa yang akan dipisahkan mempunyai sifat yang sangat bervariasi, misalnya polaritasnya, maka pemisahan dengan resolusi yang baik kadang kadang-kadang sukar terjadi.
Keadaan seperti ini didapati misalnya pada pemisahan campuran asam-asam amino, yang muatannya berbeda, atau campuran senyawa yang berbeda polaritasnya. Untuk menangani kesukaran ini dapat dilakukan dengan melaksanakan elusi gradien. Sifat fase mobil selama pemisahan diatur perubahannya, misalnya pH-nya, polaritasnya, dan sebagainya.
Elusi gradien dapat dilakukan dengan dua sistem, yaitu sistem tekanan rendah dan sistem tekanan tinggi. Perbedaannya ialah bahwa pada sistem tekanan tinggi masing-masing pelarut yang akan dipakai memerlukan pompa sendiri untuk mengaturnya. Pada sistem tekanan rendah diperlukan diperlukan katup pengatur aliran yang dikendalikan dengan suatu mikroprosessor. Dengan elusi gradien presisi data yang dihasilkan menjadi berkurang, misalnya waktu retensinya.