TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumentasi KCKT terdiri atas wadah fasa gerak, pompa, injektor, kolom, detektor, dan pengolah data. Diagram skematik alat KCKT ditunjukkan pada Gambar 2.2
Gambar 2.2 Diagram Skematik Alat KCKT (Rohman, 2009). 2.7.1 Wadah Fasa Gerak
Wadah fasa gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fasa gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fasa gerak, sebab dengan adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fasa gerak, maka akan sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam pelarut dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau dalam tabung sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.2 Pompa
Ada dua jenis pompa yang digunakan: tekanan-tetap dan pendesakan-tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi lagi menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan
peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas (Jhonson dan Stevenson, 1978).
2.7.3 Injektor
Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan, yaitu:
a. aliran henti: Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfir; sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap berada dalam tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi;
b. septum: Ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan sampai sekitar 60 - 70 atmosfir akan tetapi septum tidak dapat dipakai untuk semua pelarut kromatografi cair. Selain itu, partikel kecil terlepas dari septum dan cenderung menyumbat;
c. katup jalan-kitar: jenis injektor ini, biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum lebih besar dari pada 10 µl dan sekarang dipakai dalam sistem yang diotomatkan (volume yang lebih kecil dapat disuntikkan secara manual memakai adaptor khusus). Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi pada tekanan atmosfir. Jika katup dijalankan (dibuka), cuplikan di dalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom. Tipe injektor katup jalan-kitar secara skematik ditunjukkan pada Gambar 2.3
Gambar 2.3 Tipe Injektor Katup jalan-kitar (De Lux Putra, 2007). 2.7.4 Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Menurut Johnson dan Stevenson (1978), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
a. kolom analitik: garis tengah dalam 2–6 mm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, biasanya 10 – 30 cm.
b. kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 – 100 cm.
Kolom hampir selalu terbuat dari baja nirkarat. Kolom biasanya dipakai pada suhu kamar, tetapi suhu yang lebih tinggi dapat juga dipakai, terutama dalam kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan bergantung pada ragam KCKT yang dilakukan.
2.7.5 Fasa Diam
Fasa diam dapat berupa permukaan zat padat yang berfungsi sebagai medium yang menjerap, atau permukaan zat cair yang terdapat pada sejenis zat padat. Banyak sistem fasa diam baru telah dikembangkan untuk KCKT, dan pemakaian bahan tersebut sangat meningkatkan keefisienan dan kemampuan metode itu. Sebagian besar bahan itu didasarkan pada silika (Gritter, dkk., 1985).
Kebanyakan fasa diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fasa diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Sekarang ini, gel silika ODS atau fasa-fasa sejenis seperti gel silika oktil digunakan untuk >80% analisis farmasi namun fasa-fasa lain hanya digunakan jika diperlukan selektivitas khusus, misalnya untuk senyawa-senyawa yang sangat mudah larut dalam air atau untuk pemisahan bioanalisis yang menjadi penting karena matriks sampel tersebut menghasilkan banyak puncak yang mengganggu (Watson, 2005).
2.7.6 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrofotometri massa, golongan detektor yang spesifik hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor utraviolet-visible, detektor fluoresensi, elektrokimia. Idealnya, suatu detektor mempunyai karakteristik sebagai berikut: (a) mempunyai respon terhadap zat terlarut yang cepat dan reprodusibel; (b) mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil dan (c) stabil dalam pengoperasiannya (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.7 Pengolah Data
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dievaluasi oleh seorang analis (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.7.8 Fasa Gerak
Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fasa diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada KCKT, susunan pelarut atau fasa gerak merupakan salah satu hal penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fasa gerak yang digunakan dalam KCKT. Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kriteria fasa gerak yang ideal adalah sebagai berikut: (a) murni; (b) tidak bereaksi dengan kemasan; (c) sesuai dengan detektor; (d) dapat melarutkan cuplikan; (e) mempunyai viskositas rendah; (f) memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan; (g) harganya relatif.
2.7.9 Elusi Gradien dan Isokratik
Menurut Gritter, dkk., (1985), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
a. Sistem elusi isokratik
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fasa gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fasa gerak tetap selama elusi).
b. Sistem elusi gradien
Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran fasa gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fasa gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi gradien digunakan pada situasi yang membutuhkan pemprograman temperatur dalam kromatografi gas, dan ini dibutuhkan ketika range dari waktu retensi dari pelarut dalam kolom besar sehingga tidak dapat terlarut dan elusi dalam waktu tertentu menggunakan satu jenis atau campuran pelarut (Lindsay, 1987).