BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson, 1991).
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Munson, 1991).
Menurut Munson (1991), kelebihan KCKT antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Resolusinya baik
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik
Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif
Waktu analisis umumnya singkat
2.4.1 Cara Krom terpisah o suatu kolo fase gera penggabun kolom, fa kolom, da 2.4.2 Kom 2.4.3 Wad labu labor dapat men digunakan a Kerja KC matografi m oleh perbed om kromato ak dan fa ngan secara se gerak, p an ukuran sa mponen KC Wadah F dah fase ge ratorium dap nampung fa n harus dila CKT merupakan daan kecepa ografi. Pem ase diam. a tepat dari anjang dan ampel (Gand CKT Gamba ase Gerak erak harus b pat digunak ase gerak an akukan deg teknik ya atan elusi, misahan solu Penggunaa berbagai m n diameter k djar dan Ro ar 2 Instrum bersih dan kan sebagai ntara 1 samp gassing (pe ang mana dikarenaka ut-solut ini d an kromato macam kond kolom, kece ohman, 2007 ment Dasar K inert. Wad wadah fase pai 2 liter p enghilangan solut atau an solut-sol diatur oleh ografi cair disi operasio epatan alir f 7). KCKT dah pelarut e gerak. Wa pelarut. Fas n gas) yang zat-zat te lut ini mel distribusi d r membutu onal seperti
fase gerak,
kosong ata adah ini bia se gerak seb g ada pada erlarut lewati dalam uhkan jenis suhu aupun sanya belum a fase
dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.4 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.4.5 Injektor
Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector (autosampler). Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling sederhana (Meyer, 2004).
Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau digunakan katup injeksi (Meyer, 2004).
Katup putaran (loop valve), tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom (Meyer, 2004).
Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis (Meyer, 2004).
2.4.6 Kolom
Kolom kinerja tinggi yang dapat meminimalkan pelebaran puncak sampel adalah jantung dari sistem kromatografi cair modern. Efisiensi kolom tertinggi dapat dicapai dengan menggunakan kolom yang dipak dengan padat dan seragam dan berdiameter 5-10 μm.
Kolom dengan diameter 2 – 5 mm biasanya digunakan untuk analisis. Kolom yang lebih lebar dengan diameter antara 10 mm sampai 1 inchi (25,4 mm) dapat digunakan untuk pekerjaan preparatif. Beberapa perusahaan bahkan memasarkan kolom preparatif dengan diameter 30 cm ke atas. Kolom dengan panjang 5, 10, 15, atau 25 cm adalah umum jika digunakan fase diam mikropartikel berukuran 10 μm ke bawah. Jika diinginkan jumlah plate yang lebih tinggi maka akan lebih baik jika meggunakan packing dengan partikel yang lebih kecil daripada menggunakan kolom yang lebih panjang. Kolom yang lebih panjang meningkatkan volume retensi, sehingga mengurangi konsentrasi puncak pada zat yang terelusi.
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel, tahan terhadap tekanan KCKT normal dan relatif inert terhadap korosi kimiawi. (Meyer, 2004).
2.4.7 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan
yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1991).
Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 201 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan (Johnson dan Stevenson, 1991).
2.4.8 Pengolahan Data
Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan Stevenson, 1991).
Guna kromatogram:
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), guna kromatogram adalah sebagai berikut:
1. Kualitatif : Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.
2. Kuantitatif : Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi
2.4.9 Fase Gerak
Fase gerak harus dipilih berdasarkan sifat-sifat kromatografinya: yaitu harus berinterksi dengan fase diam yang sesuai untuk memisahkan campuran secepat
dan seefisien mungkin. Sebagai aturan umum, beberapa pelarut berpotensi dapat menyelesaikan masalah tertentu, sehingga pemilihan harus didasari oleh kriteria yang berbeda:
Viskositas: pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan perubahan tekanan yang rendah daripada pelarut dengan viskositas tingga pada laju alir spesifik. Hal ini juga dapat mnegakibatkan proses kromatografi yang lebih cepat.
Transparansi UV: jika digunakan detektor UV, fase gerak harus benar-benar transparan pada panjang gelombang yang dibutuhkan.
Indeks refraktif: hanya penting jika menggunakan detektor indeks refraktif
Titik didih: titik didih fase gerak yang rendah dibutuhkan jika zat yang terelusi ingin diperoleh kembali dan diproses lebih lanjut.
Kemurnian: kriteria ini mempunyai arti yang berbeda tergantung penggunaan yang diinginkan
Inert dengan senyawa-senyawa di dalam sampel.
Ketahanan terhadap korosi: baja bahkan bisa terkorosi dengan methanol atau asetonitril, sehingga mungkin diperlukan perawatan dengan asam nitrat atau perubahan desain instrumen.
Harga
2.4.10Dapar
Dapar diperlukan dalam kromatografi pertukaran ion dan sering juga digunakan dalam kromatografi fase balik. Jika senyawa ionik maupun senyawa yang dapat terion perlu dipisahkan, sering, walaupun tidak selalu, merupakan kebutuhan penting untuk menjalankan kromatografi pada pH tertentu. Analit
dapat dibuat menjadi sepenuhnya tidak terion maupun sepenuhnya terion, tergantung dari mode pemisahan.
Larutan dapar sering dibuat dari konsentrat yang tersedia di pasaran; jika pengenceran dilakukan dengan benar, pH yang diinginkan tidak perlu diperiksa lagi. Jika tidak tersedia konsentrat di pasaran, sebaiknya senyawa kimia yang dibutuhkan ditimbang dan diencerkan dengan volume yang sesuai (Meyer, 2004).
2.4.11 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas:
a.Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.
b.Kromatografi Fase Terbalik
Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8). Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Meyer, 2004).
2.5 Validasi metode
Validasi merupakan persyaratan mendasar yang diperlukan untuk menjamin kualitas dan hasil dari semua aplikasi analitik (Ermer, 2005).
Adapun karakteristik dalam validasi metode menurut USP (United States Pharmacopeia) yaitu akurasi (ketepatan), presisi, spesifisitas/selektifitas, batas
deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang/kisaran dan kekuatan/ketahanan dan kekasaran/ketangguhan.
2.5.1 Akurasi (Kecermatan)
Akurasi merupakan ketlitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) (Harmita, 2004).
2.5.2 Presisi (Keseksamaan)
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel yang sama dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.5.3 Spesifisitas (Selektifitas)
Spesifisitas/selektifitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan komponen lain dari sampel (Ermer, 2005).
2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan batas kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi metode yang digunakan (USP, 2007).
2.5.5 Linearitas
Linieritas adalah kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Linieritas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran sampel (analit) yang ditambahkan baku pada sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi yang mencakup seluruh rentang konsentrasi kerja (Ermer, 2005).
2.5.6 Rentang (Kisaran)
Rentang/kisaran adalah konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analitik menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang dapat digunakan untuk menganalisis sampel (Ermer, 2005).
2.5.7 Kekuatan (Ketahanan)
Kekuatan/ketahanan merupakan pengujian kemampuan dari suatu metode untuk tidak terpengaruh oleh adanya perubahan parameter dalam melakukan metode analitik seperti persentase kandungan pelarut organik dalam fase gerak, pH larutan dapar, waktu pengekstraksian analit, komposisi pengekstraksi dan perbandingan konsentrasi fase gerak (Épshtein, 2004).
2.5.8 Kekasaran (Ketangguhan)
Kekasaran/ketangguhan merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh dengan kondisi yang bervariasi dan dinyatakan sebagai simpangan baku relative relative standard deviation (RSD). Kondisi ini meliputi laboratorium, analis, reagen dan waktu percobaan yang berbeda (Gandjar dan Rohman, 2007).
