BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair
menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (Depkes RI, 1995). 2.5.1 Bagian-Bagian dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Pompa
Fase gerak dalam KCKT sudah tentu zat cair dan untuk menggerakkannnya melalui kolom diperlukan alat. Ada dua jenis utama pompa yang digunakan yaitu tekanan-tetap dan pendesakan-tetap. Pompa pendesakan tetap dapat dibagi dalam lagi menjadi pompa torat dan pompa semprit. Pompa torat menghasilkan aliran yang berdenyut, jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Kelebihan utamanya ialah tandonnya tidak terbatas. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas (Johnson, 1991).
2. Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu :
a. aliran-henti
Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer, sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi (biasanya sistem aliran utama tetap pada tekanan kerja). Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi.
Ini adalah injektor langsung pada aliran yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan sampai sekitar 60-70 atmosfer. Setpum tidak dapat dipakai pada semua pelarut kromatografi cair
c. katup jalan-kitar
Biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 mikro liter dan sekarang dipakai dipakai dalam sistem yang diotomatkan (Johnson, 1991).
3. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
a. kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm
b. kolom preparatif
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm (Johnson, 1991).
4. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam efluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar, dan menanggapi semua jenis
senyawa. Detektor yang merupakan tulang punggung kromatografi cair kecepatan tinggi modern ialah detektor UV 254 nm (Johnson, 1991).
5. Elusi landaian
Elusi landaian ialah peningkatan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi. Hasil elusi landaian ialah perpendekan waktu tambat senyawa yang ditahan dengan kekuatan dalam kolom. Dasar-dasar elusi landaian diuraikan oleh Snyder. Elusi landaian mempunyai beberapa keuntungan yaitu :
a. waktu analisis keseluruhan dapat dikurangi secara berarti
b. daya pisah keseluruhan per satuan waktu campuran ditingkatkan c. bentuk puncak diperbaiki (pembentukan ekor lebih kecil)
d. kepekaan efektif ditingkatkan karena bentuk puncak kurang beragam (Johnson, 1991).
6. Fase Gerak
Pada kromatografi cair, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu peubah yang mempengaruhi pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua ragam KCKT, tetapi ada beberapa sifat yang diinginkan yang berlaku umum. Fase gerak haruslah:
a. murni, tanpa cemaran;
b. tidak bereaksi dengan kemasan; c. sesuai dengan detektor;
d. dapat melarutkan cuplikan; e. mempunyai viskositas rendah;
g. harganya wajar
Pada umumnya pelarut dibuang setelah dipakai karena tata kerja pemurnian memakan waktu dan mahal (Jayanti, 2011).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Jayanti, 2011).
7. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing ( penghilangan gas ) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat
pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT ( HPLC grade ). Adanya pengotor dalam dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel kecil ini (Jayanti, 2011).
2.5.2 Keuntungan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi mempunyai banyak keuntungan jika dibandingkan dengan kromatogarafi tradisional yaitu :
a. cepat.
b. daya pisah baik.
c. peka dan detektor unik. d. kolom dapat dipakai kembali. e. ideal untuk molekul besar dan ion.
BAB III