BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.5 Kromatografi
2.5.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair
menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil (3 µ m hingga 50 µ m). Oleh karena itu sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 200 µg) (Ditjen POM, 1995).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sistetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi (Rohman, 2007).
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam (Rohman, 2007).
Pada dasarnya alat kromatografi cair terdiri dari sistem pompa, tempat penyuntikan analit, kolom kromatografi, detektor, penguat sinyal, dan perekam (Ditjen POM, 1995).
2.5.3.1 Jenis-jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Proses pemisahan dalam KCKT dapat dilakukan dengan berbagai mode kromatografi yaitu sebagai berikut:
a. Kromatografi padatan-cairan (kromatografi adsorpsi)
Pemisahan biasanya menggunakan fase normal dengan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini menggunakan silika sebagai fase diamnya. Fase gerak yang digunakan berupa pelarut non polar yang ditambah dengan pelarut polar seperti air atau alkohol rantai pendek untuk meningkatkan kemampuan elusinya, misal n-heksana ditambah dengan metanol (Rohman, 2007). Dengan mode ini dapat dipisahkan antioksidan, vitamin, steroid, barbiturat, zat warna, amina, hidrokarbon, fenol, alkaloida, lipida, asam-asam amino, dan alkohol-alkohol (Hadjar, 1985).
b. Kromatografi cairan-cairan (kromatografi partisi)
Fase diam berupa cairan yang disalutkan atau diikatkan secara kimia pada solid. Komponen sampel yang dipisahkan berpartisi di antara fase diam dan fase gerak (Hadjar, 1985). Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahan adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer (Rohman, 2007).
c. Kromatografi penukar ion
Kromatografi ini menggunakan fas ediam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Kebanyakan pemisahan dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol (Roman, 2007).
d. Kromatografi pasangan ion
kromatografi ini merupakan bentuk khusus dari kromatografi cairan-cairan yang digunakan untuk pemisahan senyawa obat yang dapat terionisasi seperti sulfonamida, karboksilat dan sulfonat (Hadjar, 1985).
2.5.3.2 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Sistem KCKT sederhana terdiri dari wadah fase gerak, pompa bertekanan tinggi, injektor, kolom, detektor, dan perekam. Gambar ilustrasi dapat dilihat pada gambar 5 (McMaster, 2007).
Gambar 5. Sistem KCKT isokratik
2.5.3.2.1 Wadah fase gerak
Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Pelarut yang digunakan harus bebas dari partikel debu dan partikel padat. Pelarut seharusnya disaring
dengan penyaring mikrometer sebelum digunakan pada sistem KCKT. Degassing digunakan untuk menghilangkan gas terlarut dalam fase gerak dan menghilangkan gas terlarut dalam fase gerak dan mengurangi kemungkinan gelembung yang terbentuk pada pompa atau detektor selama proses pemisahan (Putra, 2007).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut (Rohman, 2007).
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), fase gerak haruslah: a. Murni, tanpa cemaran.
b. Tidak bereaksi dengan kemasan. c. Sesuai dengan detektor.
d. Dapat melarutkan cuplikan. e. Mempunyai viskositas rendah.
f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan.
g. Harganya wajar.
Menurut Putra (2007), elusi pada KCKT dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu:
a. Sistem elusi isokratik: elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap.
b. Sistem elusi gradien: elusi dilakukan dengan campuran fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu.
2.5.3.2.2 Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan pompa dengan tekanan tetap (Rohman, 2007).
2.5.3.2.3 Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel internal atau eksternal (Rohman, 2007).
Menurut Johnson dan Stevenson (1991), ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:
a. Aliran-henti: aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer; sistem ditutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Cara ini dapat dipakai karena difusi di dalam zat cair kecil, jadi umumnya daya pisah tidak dipengaruhi.
b. Septum: ini adalah injektor langsung pada aliran, yang sama dengan injektor yang lazim dipakai pada kromatografi gas. Injektor tersebut dapat dipakai pada tekanan sampai sekitar 60-70 atmosfer. Septum tidak dapat dipakai pada semua pelarut KC. Selain itu, partikel kecil terlepas dari septum dan cenderung menyumbat.
c. Katup jalan-kitar: jenis injektor ini biasanya dipakai untuk menyuntikkan volum yang lebih besar dari 10 μl dan sekarang dipakai dalam sistem yang diotomatkan. Pada kedudukan mengisi, jalan-kitar cuplikan diisi pada tekanan atmosfer. Jika katup dibuka, cuplikan di dalam jalan-kitar teralirkan ke dalam kolom.
2.5.3.2.4 Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau tidaknya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar (Putra, 2007).
Menurut Edward dan Stevenson (1991), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:
a. Kolom analitik: garis tengah-dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
b. Kolom preparatif: umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm.
2.5.3.2.5 Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugs silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupaka fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi (Rohman, 2007).
2.5.3.2.6 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikandi dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisaran respon linear yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Detektor yang paling banyak digunakan dalam KCKT adalah detektor spektrofotometer uv 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang uv-vis sekarang menjadi poluler karena dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas (Putra, 2007).