BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
A. Makuta dewa
3. Kromatografi Kertas Dua Dimensi (KKt 2A)
Kadang-kadang dalam pemisahan bercak yang terdiri atas dua bercak atau lebih pada kromatografi kertas satu arah (KKt 1A) tidak terpisahkan dengan baik. Karena alasan tersebut perlu dilakukan pemisahan dengan kromatografi kertas dua dimensi (KKt 2A). Kertas yang disarankan untuk tujuan ini ialah kertas Whatman 3MM (46 x 57cm) atau yang setara. Jumlah ekstrak yang ditotolkan dapat merupakan faktor kritis yang menentukan mutu flavonoid yang terjadi kemudian. Bila ekstrak yang ditotolkan terlalu sedikit, bercak flavonoid yang terbentuk mungkin sukar untuk dideteksi, sedangkan bila lerlalu banyak maka akan terjadi pencorengan dan resolusi menjadi jelek (Markham, 1988).
Namun bila cara diatas tidak memungkinkan untuk dilakukan disebabkan ukuran lembaran kertas dan bejana kromatografi yang terlalu besar, maka pcnyesuaian ukuran dapat dilakukan. Bejana kaca yang lebih kecil dapat dipakai bila lembar kertas dibagi dua atau empat sebelum ekstrak ditotolkan, Tetapi bila hal itu dilakukan, ukuran bercak yang ditotolkan dan jumlah ekstrak yang ditotolkan harus disesuaikan (Markham, 1988).
Untuk penilaian kandungan flavonoid suatu ekstrak, sudah menjadi kebiasaan umum untuk menggunakan pengembang beralkohol pada pengembangan pertamanya. Demikian juga dalam KKt dua dimensi ini. Untuk pengembangan pertama dapat digunakan pengembang n-butanol:asam asetat:air (BAA 4:1:5, fase atas) atau t-butanol:asam asetat:air (TBA 3:1:1) menurut arah tepi kertas yang terpanjang. Garis depan pengembang akan mencapai ujung lembaran kertas dalam waktu 12-30 jam (kira-kira membutuhkan 50-60 ml pengembang per kertas). Untuk pengembangan arah kedua dapat digunakan pengembang berupa larutan dalam air seperti larutan asam asetat 15%, dengan menggunakan bejana lain. Waktu yang dibutuhkan dalam pengembangan arah kedua ini 4-6 jam (Markham, 1988).
Cara lain adalah dengan menggunakan pengembang yang berbeda. Beberapa dari pengembang yang banyak tersedia dicantumkan pada tabel I, yang disertai dengan ulasan tentang penggunaan yang sebaiknya. Sebagian pengembang tersebut boleh digunakan setelah penggunaan BAA atau TBA yang biasanya merupakan pengembang terbaik dari segi kekuatan pelarut dan pemisahan bercak (Markham, 1988).
Tabel. I. Pengembang pada analisis flavonoid dengan kromatografi kertas (Markham, 1988).
Pengembang Susunan pengembang (jangka
waktu pengembangan)
Penggunaan yang dianjurkan*
BAA n-
BuOH;HOAc;H2O(4:1:5);dicam
pur baik-baik dalam corong pisah, dipakai fase atas (17 jam)
Glikosida, aglikon, dan gula (24-48 jam), glukosa dan galaktosa tak terpisahkan
TBA t-BuOH;HOAc;H2O (3:1:1) (24
jam)
Seperti pada BAA
KAA CHCl3:HOAc:H2O (30:15:2);
campur baik-baik dalam corong pisah, air yang berlebih dibuang (5-7 jam)
Aglikon (terutama yang dimetilasi),
glikosida yang diasilasi, glikosida yang
dimetilasi. Baik untuk memisahkan
isoramnetilkemferol/siringetin/laristrin (pola OH pada cincin B sama)
Forestal HOAc:H2O:HCl (30:10:3) (15
jam)
Flavon, flavonol, dan aglikonantosianidin. Sering tidak dapat memisahkan glikosida dari aglikon
Asam Format HCOOH:H2O:HCl (5:3:2) Antosianidin. Dapat memisahkan glikosida
dari aglikon (Bandingkan dengan forestal) Bu/HCl n-BuOH:HCl 2M (1:1); campur
baik-baik dalam corong pisah dan setimbangkan semalam (24 jam)
Antosianin (sebelum pengembangan kertas harus disetimbangkan dalam uap pengembang)
BEA n-BuOH:EtOH:H2O (4:1:2,2);
jika tidak mencampur pada suhu kamar tambah lagi sedikit EtOH (20-24 jam)
Pengembang berkemampuan rendah, ideal untuk pemurnian ahkir glikosida glikosida
dan gula yang hampir murni
Benzena- asam asetat- air
Bz:HOAc:H2O (125:72:3);
pengembang atsiri, jadi perlu penjenuhan bujana bejana (4 jam)
Aglikon, asam fenolat
EPAA EtOAc:Pir:HOAc:H2O
(36:36:7:21)
Gula, terutama KLT
Fenol Fenol (4g): H2O (1 ml).
Keringkan kromatogram dalam tanur berventilasi (50-60oC) selama 2-3 jam lalu dalam lemari asam 24 jam (untuk menghilangkan fenol) (24 jam)
Glikosida, memisahkan visenin-2 dari skaftosida; glukoronida<glikosida; ramnosida>glukosida. Dapat memisahkan glukosa dari alosa dan galaktosa. Gula (30- 48 jam)
H2O (4 jam) Glikosida, biasanya O-Glukoronida>C- Glukosida>O-Glukosida. Ideal untuk membedakan antara O-Glukoronida dan O-
glikosida lain HOAc HOAc 5% (3jam)
HOAc 15% (5 jam)
HOAc 50% (12 jam); terbaik jika “lewat kembang”
Poliglikosida
Glikosida. Baik untuk membedakan antara mono-, di-, triglikosida
Aglikon
HCl 1% (5 jam) Antosianin, asam fenolat BBPA n-BuOH:Bz:Pir:H2O (5:1:3:3)
(20 jam)
Gula. Memisahkan glukosa dari galaktosa, xilosa, dan arabinosa
*Lambang <,> menunjukan kelincahan bercak Untuk lembaran kertas besar
Letak bercak yang menggunakan fase diam selulosa yang dikembangkan dua arah dengan dua macam fase gerak (TBA/HOAc) juga merupakan informasi yang berharga karena dapat untuk mengetahui apakah suatu flavonoid merupakan aglikon/glikosida (Mabry. Et al., 1970).
Cara lain yang paling mudh untuk mendeteksi flavonoid adalah dengan mengamati perubahan warna sebelum dan sesudah diuapi amonia. Flavonoid
merupakan golongan senyawa fenol yang bersifat asam, sehingga menimbulkan perubahan warna yang khas dengan adanya amonia (Markham, 1988). Jika tidak tercampur dengan pigmen lain, flavonoid dapat dideteksi dengan uap amonia dan akan menimbulkan warna yang spesifik untuk masing-masing golongan. Flavon dan flavonol memberikan warna kuning kemerahan. Antosianin berwarna merah biru, sedangkan flavanon memberikan warna oranye atau coklat. Warna merah dan lembayung yang mendadak dalam suasana basa disebabkan oleh adanya khalkon atau auron (Robinson, 1995).
Tabel II. Hubungan warna bercak dengan struktur flavonoid (Mabry et al., 1962) Warna bercak flavonoid
UV 366 nm NH3/UV 366 nm
Tipe flavonoid
Violet tua Kuning, kuning hijau
atau hijau
Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna
Biru muda merah atau jingga
a. Biasanya 5-OH flavon atau flavonol (tersulih ada 3-O dan mempunyai 4’-OH)
b. Flavanon 5-OH dan 4’-OH
khalkon tanpa OH pada cincin B a. flavon atau flavonol tersulih pada
3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH bebas.
b. 6- atau 8-OH flavon dan flavonol tersulih pada 3-O serta mengandung 5-OH
c. Isoflavon, dihidroflavonol, biflavonil dan flavanon dengan 5-OH
d. Calkon dengan 2’- atau 6’-OH tetapi tidak memiliki 2- atau 4- OH bebas
flavanon dengan 5-OH
calkon dengan gugus hidroksil bebas pada posisi 2- atau posisi 4- Fluoresensi biru muda Fluoresensi hijau-
kuning atau hijau-biru
a. flavon dan flavanon yang tak mengandung 5-OH, misalnya 5- OH-glikosida
b. flavonol tanpa 5-OH bebas tetapi tersulih pada 3-OH
Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna Fluoresensi murup biru terang
Isoflavon yang tak mengandung 5- OH bebas
Isoflavon yang tak mengandung 5- OH bebas
Tidak tampak Fluoresensi biru muda Isoflavon yang tak mengandung 5- OH bebas
Kuning redup dan kuning atau fluoresensi jingga
Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna
Flavonol dengan 3-OH bebas dan atau tanpa 5-OH bebas (kadang-
kadang berasal dari dihidroflavonol)
Fluoresensi kuning
,
Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan calkon 2- atau 4-OH
Kuning-hijau atau hijau-biru atau hijau
Perubahan warna sedikit atau tanpa perubahan warna
a. Auron yang tak mengandung 4’- OH bebas dan flavanon tanpa 5- OH bebas
b. Flavanol yang mengandung 3- OH bebas dan dengan atau tanpa 5-OH bebas
Merah jingga redup atau merah senduduk
Biru Antosianidin 3-glikosida
Merah jambu atau fluoresensi kuning
Biru Antosianidin 3,5-diglikosida
Hasil dari KKt 2A ini dapat juga digunakan untuk mengisolasi flavonoid dengan cara bercak yang sesuai digunting dari kromatogram, lalu bercak yang sama digabungkan dan setelah digunting menjadi potongan kecil-kecil diekstraksi dengan pelarut yang sesuai (biasanya digunakan metanol (MeOH)). Bila diperlukan, hasil pemisahan KKt 1A dapat digabungkan dengan hasil pemisahan KKt 2A hasil replikasi agar diperoleh flavonoid murni (Markham, 1988).