BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.6 KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Anonim, 1995).
Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan mekanisme pemisahannya dibedakan menjadi kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi ukuran, dan kromatografi afinitas. Sedangkan berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi menjadi kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi, dan kromatografi gas (Gandjar & Rohman, 2007). Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan mengunakan salah
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
satu atau gabungan dari beberapa teknik tersebut dan dapat digunakan pada skala mikro maupun makro (Harbone, 1987).
Dalam penggunaan kromatografi untuk tujuan kualitatif dapat mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan. Sedangkan untuk tujuan kuantitatif dapat menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran. Selain penggunaan kualitatif dan kuantitatif, kromatografi dapat digunakan untuk tujuan preparatif yaitu untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni. Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yanng simetris atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).
2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode pilihan kromatografi secara fisikokimia (Gandjar & Rohman, 2007). KLT merupakan bentuk planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini merupakan bentuk terbuka dari kromatografi kolom.
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai hasul kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom. Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif, KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa organik dalam jumlah kecil, misalnya menentukan jumlah komponen dalam campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya (Townshend, 1995).
Plat KLT yang umum digunakan adalah plat KLT analitik dengan ketebalan 0,1-0,2 nm dengan ukuran 20x20 cm yang dilapisi dengan adsorben silika gel 60 F254 dengan ketebalan 0,2 mm. Plat kemudian ditempatkan ke dalam
bejana dengan fase gerak yang sesuai, dimana ketinggian fase gerak cukup untuk membasahi bagian bawah plat dan tidak sampai membasahi dimana sampel diaplikasikan. Fase gerak kemudian bermigrasi melewati adsorben dengan gaya kaliper, dan proses ini dikenal sebagai pengembangan (Sarker, Latif, & Gray, 2006).
Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan deteksi bercak. Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai retardation factor (Rf). Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007). Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh, dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gocan, 2002). Adsorben yang umumnya digunakan dalam KLT meliputi :
1. Silika Gel
Silika gel adalah yang paling banyak digunakan sebagai adsorben dan fase stasioner yang dominan untuk KLT. Sebagian besar analisa dengan KLT dilakukan dengan menggunakan fase normal lapisan silika gel.
Silika gel ini dapat digunakan sebagai fase polar maupun non polar. Untuk fase polar, merupakan silika yang dibebaskan dari air dan bersifat sedikit asam. Silika gel perlu ditambah gips (kalsium sulfat) untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung. Sebagai pendukung biasanya lapisan tipis digunakan kaca dengan ukuran 20x20 cm, 10x20 cm, atau 5x10 cm. Pendukung yang lain berupa lembaran alumunium atau plastik seperti ukuran diatas yang umumnya dibuat oleh pabrik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Silika gel kadang-kadang ditambah senyawa fluoresensi, agar bila disinari dengan sinar UV dapat berfluoresensi atau berpendar, sehingga dikenal sebagai silika gel 60 F254 yang berarti silika gel untuk fase non polar terbuat dari silika yang dilapisi dengan senyawa non polar misalnya, lemak, parafin, minyak silikon raber gom, atau lilin, dengan fase gerak air yang bersifat polar dapat digunakan sebagai eluen. Fase diam ini dapat memisahkan banyak senyawa namun elusinya sangat lambat dan keterulangannya kurang bagus (Sumarno, 2001).
2. Alumina
Alumina ini bersifat sedikit basa, lebih jarang digunakan. Saat akan digunakan harus diaktifkan kembali dengan pemanasan. Alumina yang digunakan sebagai fase diam untuk KLT umunya yang bebas air, sehingga mempunyai aktivitas penjerapan lebih tinggi (Sumarno, 2001).
3. Perlit Mineral
Perlit mineral adalah adsorben baru untuk KLT, yang dibuat dengan mengkonversi SiO2 (70-75%) menjadi silikat yang larut dengan Na2CO3 (Gocan, 2002).
4. Kiselgur
Kiselgur ini sebenarnya merupakan asam silika yang berbentuk amorf, berasal dari kerangka diatomae, maka lebih dikenal dengan nama tanah diatome, kurang bersifat adsorptif dibanding silika (Sumarno, 2001).
5. Magnesium Silikat
Magnesium silikat hanya digunakan bila adsorben atau penjerap lain tidak dapat digunakan. Nama lain dalam perdagangan dikenal floresil (Sumarno, 2001). Floresil (magnesium silikat) adalah endapan silika dan magnesium. Sifat dan aplikasi dari floresil pada KLT dan KCKT ditinjau dan dibandingkan dengan adsorben lainnya (Gocan, 2002).
6. Selulosa
Selulosa mempunyai polaritas tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pemisahan secara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun bentuk lempeng. Kedua bentuk tersebut masih sering digunakan untuk pemisahan flavonoid. Ukuran partikel yang digunakan kira-kira 50 µm. Fase diam ini sekarang sudah diganti dengan bubuk selulosa yang dapat dilapisi pada kaca seperti halnya fase
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
diam yang lain sehingga lebi efisien dan lebih banyak digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa polar atau isomernya (Sumarno, 2001).
7. Resin
Resin berfungsi sebagai fase pada KLT penukar ion. Resin merupakan polimer dari stirendifenil yang mengalami kopolimerisasi, bersifat non polar. Fase diam ini sangat berguna untuk memisahkan senyawa berbobot molekul tinggi dan bersifat amfoter seperti asam amino, protein, enzim, nukleotida. Sebagai fase gerak digunakan larutan asam kuat atau basa kuat (Sumarno, 2001).
Gambar 3. Kromatografi Lapis Tipis
(Sumber : http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html) Harga Rf dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana persamaan berikut :
Harga maksimum Rf adalah 1, sampel bermigrasi dengan kecepatan sama dengan fase gerak. Harga minimum Rf adalah 0, dan ini teramati jika sampel tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).
2.6.2 Kromatografi Gas – Spektrometri Massa/Gas Chromatography Mass Spectrometry
Kromatografi Gas (KG) merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa yang mudah menguap dalam suatu
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
campuran. Kegunaan umum KG yaitu untuk melakukan pemisahan dinamis dan identifikasi semua jenis senyawa organik yang mudah menguap dan juga untuk melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa dalam suatu campuran (Gandjar & Rohman, 2007).
KG merupakan teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah menguap (dan stabil terhadap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang bergantung pada rasio distribusinya. Pada umumnya solut akan terelusi berdasarkan pada peningkatan titik didihnya, kecuali jika ada interaksi khusus antara solut dengan fase diam. Pemisahan pada KG didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50oC-350oC) bertujuan untuk menjamin bahwa solut akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi (Gandjar & Rohman, 2007).
Komponen utama pada KG adalah kontrol dan penyedia gas pembawa, ruang suntik sampel, kolom yang diletakkan pada oven yang dikontrol secara termostatik, sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder) serta komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data (Gandjar & Rohman, 2007).
1. Fase gerak pada KG
Fase gerak ada KG disebut juga sebagai gas pembawa karena tujuan awalnya adalah membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa yaitu tidak reaktif, murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor, dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi.
Gas pembawa biasanya mengandung gas helium, nitrogen, hidrogen, atau campuran argon dan metana. Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis detektor yang digunakan.
2. Ruang suntik sampel pada KG
Fungsi dari ruang suntik ini adalah untuk mengantarkan sampel ke dalam aliran gas pembawa. Penyuntikan sampel dapat dilakukan secara manual atau otomatis.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sampel yang akan dikromatografi dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang biasanya berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang suntik harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan biasanya 10 oC -15oC lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum.
3. Kolom pada KG
Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada KG. Jenis kolom pada KG yaitu kolom kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column).
Kolom kemas (packing column) terbuat dari gelas atau logam tahan karat atau dari tembaga dan alumunium. Panjang jenis kolom ini adalah 1-5 meter dengan diameter dalam 1-4 mm. Efisiensi kolom akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya partikel fase diam ini. ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara 60-80 mesh (250-170 μm)
Sedangkan kolom kapiler (capillary column) berbeda dengan kolom kemas, dalam hal adanya rongga pada bagian dalam kolom yang menyerupai pipa (tube). Oleh karena itu, sering disebut “open tubular columns”. Banyak macam bahan kimia yang digunakan sebagai fase diam antara lain : squalen, dietilglikol suksinat, OV-17 (phenyl methyl silicone oil). Semakin tipis lapisan penyalut sebagai fase diam, maka semakin tinggi suhu operasionalnya.
4. Detektor pada KG
Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah diantara fase diam dan fase gerak.
Jenis-jenis detektor yang sering digunakan antara lain : detektor hantar panas, detektor ionisasi nyala, detektor tangkap elektron, detektor nitrogen-fosfor, detektor fotometri nyala, detektor konduktivitas elektrolitik, detektor foto-ionisasi, dan detektor spektrofotometer massa.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
5. Komputer
KG modern menggunakan komputer yang dilengkapi dengan perangkat lunaknya (software) untuk digitalisasi sinyal detektor dan mempunyai beberapa fungsi antara lain :
a. Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen.
b. Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan menggunakan grafik berwarna.
c. Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistik.
d. Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu.
Spektrometri Massa adalah suatu instrumen yang dapat menyeleksi molekul-molekul gas bermuatan berdasarkan massanya. Spektrum massa diperoleh dengan dengan mengubah senyawa cuplikan menjadi ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (Fessenden & Fessenden, 1992).
Prinsip kerja KG-SM yaitu cuplikan disuntikkan ke dalam injektor. Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen dari cuplikan. Komponen-komponen tersebut akan terelusi sesuai dengan urutan semakin membesarnya koefisien partisi, selanjutnya masuk ke dalam spektrometri massa. Pada spektrometri massa komponen cuplikan ditembaki dengan berkas elektron dan diubah menjadi ion-ion bermuatan positif yang bertenaga tinggi dan dapat pecah menjadi ion-ion yang lebih kecil. Lepasnya elektron dari molekul/komponen-komponen menghasilkan radikal kation. Ion-ion molekul, ion-ion pecahan, dan ion-ion-ion-ion radikal pecahan dipisahkan oleh ion-ion pembelokan dalam medan magnet yang berubah sesuai dengan massa dan muatannya. Perubahan tersebut menimbulkan arus ion yang kemudian dicatat sebagai spektra massa (Sastrohamidjojo, 1985).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4. Kromatografi Gas – spektrofotometri massa (sumber : http://prezi.com/j9bkyznkpt-w/gcms/)
2.6.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
HPLC digunakan untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian, analisis senyawa yang tidak mudah menguap, penetuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, dll. HPLC metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif ( (Gandjar & Rohman, 2007).
Hampir semua jenis campuran solut dapat dipisahkan dengan HPLC karena banyaknya fase diam yang tersedia dan selektifitas yang dapat ditingkatkan dengan mengatur fase gerak. Pemisahan dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik tergantung pada polaritas relatif fase diam dan fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007).
Komponen-komponen penting dalam HPLC yaitu : a. Wadah fase gerak
b. Sistem penghantaran fase gerak c. Injektor
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d. Kolom e. Detektor
f. Wadah penampungan buangan fase gerak g. Tabung penghubung
h. Suatu komputer
Gambar 5. High Performance Liquid Chromatography
(sumber : http://pioneer.netserv.chula.ac.th/~skitipat/hplc/howto.html)
