E. Mekanisme Penghambatan Proliferasi sel kanker oleh Senyawa-senyawa
46 Kromatogram HPLC hasil analisis dan fraksinasi kitooligomer
xvii
Nomor Halaman
1. Inform concern dari responden ... 107
2. Konsentrasi preparat hasil reaksi enzimatik ... 108
3. Kromatogram HPLC senyawa-senyawa kitooligomer ... 109
A. Latar Belakang
Banyak komponen bioaktif pangan saat ini diketahui mempunyai efek positif terhadap kesehatan, oleh karena itu penggunaan pangan yang diketahui mengandung senyawa bioaktif atau pangan fungsional merupakan hal yang sangat bermanfaat. Pangan yang kita konsumsi sehari-hari pada kenyataannya mengandung ribuan senyawa bioaktif, banyak diantaranya yang memiliki cukup potensi untuk meningkatkan kesehatan, contohnya adalah sulphoraphane, kurkumin, likopen, dan polifenol dalam teh yang merupakan agen chemopreventive yang telah terbukti (Elliot dan Ong 2002). Saat ini penggunaan pangan fungsional untuk kesehatan telah berkembang pesat, salah satu faktor pendukungnya adalah keinginan banyak orang untuk meningkatkan kesehatan dengan cara yang alami. Hal tersebut dilatarbelakangi oleh berbagai efek samping yang merugikan dari konsumsi obat-obatan kimiawi yang telah banyak terbukti, sehingga timbul keinginan untuk menggunakan bahan-bahan dari alam untuk meningkatkan kesehatan. Selain faktor tersebut, konsumsi makanan yang tidak seimbang juga telah terbukti menjadi kunci dari faktor eksternal yang berpengaruh pada kejadian penyakit-penyakit kronis, termasuk terjadinya penyakit- penyakit kanker. Upaya pencegahan terhadap berbagai jenis penyakit termasuk penyakit kanker secara dini melalui pangan yang sehat meningkatkan konsumsi komponen bioaktif sebagai pangan fungsional. Disamping itu penggunaan komponen bioaktif dari bahan-bahan alami dengan tujuan untuk pengobatan penyakit dalam bentuk nutraceuticals kini sudah banyak dijumpai, termasuk senyawa -senyawa kitooligo mer yang berasal dari degradasi limbah bahan berkitin saat ini mulai digunakan sebagai bahan nutraceuticals. Senyawa kitooligomer ini telah menarik perhatian industri karena berbagai manfaatnya untuk pangan dan medis, sehingga memiliki nilai ekonomis cukup baik untuk dikembangkan saat ini, dengan harga jual di pasaran internasional yang telah mencapai US$ 60.000 per ton (Sandford 2003).
Banyak penelitian telah membuktikan bahwa senyawa -senyawa kitooligomer yang berasal dari limbah berkitin memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai material anti kanker, antara lain senyawa heksa N-asetil kitoheksaose dan kitoheksaose yang berasal dari degradasi kitin. Senyawa -senyawa kitooligomer yang berasal dari degradasi kitosan telah dilaporkan memiliki pengaruh menghambat pertumbuhan dan proliferasi sel tumor. Oleh sebab itu kajian dalam penelitian ini
dipandang sangat penting dilakukan untuk usaha peningkatan nilai tambah limbah berkitin melalui usaha produksi senyawa bioaktif kitooligomer yang dapat diaplikasikan sebagai pangan fungsional dan nutraceutical.
Limbah berkitin di Indonesia pada tahun 2002 dihasilkan sekitar 112.208 ton (Anonim 2004). Limbah ini belum termanfaatkan secara baik dan berdaya guna, bahkan sebagian besar merupakan buangan yang juga turut mencemari lingkungan. Oleh karena itu perlu dilakukan berbagai usaha penggalian potensi lokal untuk memanfaatkan limbah berkitin menjadi bahan yang bermanfaat, antara lain mengolahnya menj adi kitosan dan oligomernya. Saat ini produk kitosan dan oligomernya telah banyak dijual dalam bentuk kapsul nutraceutical dan pharmaceutical dengan berbagai merek dagang yang umumnya berasal dari Korea dan Jepang.
Senyawa-senyawa kitooligomer dapat diproduksi secara enzimatik dari senyawa kitin dengan menggunakan enzim kitinase, kitin deasetilase dan kitosanase. Kitin deasetilase memodifikasi kitin menjadi kitosan. Kitosanase menguraikan kitosan menjadi senyawa-senyawa kitooligomer. Proses pengubahan kitin menjadi turunan oligosakarida secara kimiawi oleh asam cenderung dihindari karena proses ini tidak dapat dikontrol dan menghasilkan lebih banyak monomer D-glukosamin dan lebih sedikit oligomer, sedangkan yang memiliki aktivitas biologi penting adalah senyawa oligomernya. Hidrolisis kitosan secara enzimatis adalah cara yang lebih baik untuk mendapatkan senyawa-senyawa kitooligomer dengan derajat polimerisasi yang lebih tinggi. Ukuran molekul produk akhir hidrolisis sangat penting diperhatikan karena sifat fungsional bergantung pada berat molekulnya.
Penggunaan enzim sebagai biokatalis dalam industri obat-obatan, kosmetika, dan bioteknologi menjadi pilihan yang terbaik saat ini, karena bersifat ramah lingkungan, prosesnya mudah dikendalikan, dan produk akhirnya seragam. Penggunaan enzim termostabil dalam penelitian ini dimaksudkan karena sifat stabilitas enzim terhadap proses panas, sebab sifat enzim yang stabil pada kondisi panas diminati oleh kalangan industri karena memiliki nilai ekonomis yang lebih tinggi, antara lain reaksi dapat berlangsung pada suhu tinggi sehingga mengurangi kontaminasi bakteri mesofil dan laju reaksi lebih cepat sehingga mengurangi biaya produksi. Selain itu enzim termostabil dari mikroba termofil lebih tahan terhadap berbagai senyawa atau keadaan penyebab denaturasi sehingga dapat lebih tahan disimpan. Sifat stabil yang dimiliki enzim termofil menekan peluang kehilangan aktivitas selama produksi dan penyimpanan, serta memudahkan para teknolog dalam menangani proses produksi
dan pemurniannya (Suhartono 1994). Indonesia merupakan negara yang kaya diversitas sehingga peluang menemukan mikroba termofil penghasil enzim yang unik cukup realistik. Salah satu mikrob termofilik penghasil enzim kitosanase dari Indonesia yang telah berhasil dipilah dari sumber air panas di Tompaso Sulawesi Utara adalah
Bacillus licheniformis MB2. Diharapkan enzim dari mikroba ini dapat bermanfaat bagi proses industri dan bioteknologi, salah satunya adalah dapat digunakan untuk memproduksi senyawa bioaktif kitooligomer yang memiliki banyak manfaat.
Berdasar latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini dilakukan kajian produksi senyawa kitooligomer yang bersifat bioaktif dengan menggunakan enzim kitosanase yang dihasilkan oleh isolat Bacillus licheniformis MB2 yang telah dikarakterisasi sebelumnya secara menyeluruh oleh Chasanah (2004). Bakteri tersebut diketahui menghasilkan kitosanase pada pH optimum 6-7, stabil terhadap kisaran pH 4 – 6.8, tahan panas (suhu optimum 70oC) dan tahan senyawa denaturan ( terutama guanidin dan urea). Selanjutnya penelitian ini ditujukan untuk menghasilkan senyawa- senyawa kitooligomer yang memiliki aktivitas biologis sebagai anti kanker, sehingga senyawa-senyawa kitooligomer dapat dijadikan material anti kanker bagi pengobatan penyakit kanker di masa datang.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk: (1) Mengaplikasi enzim kitosanase termostabil dari
Bacillus licheniformis MB2 untuk memproduksi senyawa -senyawa kitooligomer yang memiliki aktivitas biologi khususnya terhadap sel limfosit dan sel kanker (2) Menganalisis potensi anti kanker dari senyawa-senyawa kitooligomer.
C. Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini adalah :
1. Enzim kitosanase dari Bacillus licheniformis MB2 dapat digunakan untuk memproduksi senyawa-senyawa kitooligomer yang memiliki aktivitas biologi terhadap sel limfosit dan sel kanker.
2. Senyawa-senyawa kitooligomer mampu menghambat proliferasi sel kanker melalui mekanisme kerusakan membran, apoptosis, dan kemungkinan sebagai inhibitor enzim serin protease.
A. KITOSAN, KITOOLIGOMER DAN KITOSANASE
1. Kitosan dan Aplikasinya.
Kitosan adalah biopolimer yang tersusun atas D-glukosamin dengan ikatan glikosidik â 1 4 yang dapat dihasilkan dari kitin, yaitu polimer linier â (1 4)-2- asetamido-2-deoxy-D-glukosa (N-asetilglukosamin). Kitin adalah komponen utama pada kulit kepiting dan udang atau kelompok kerang-kerangan (crustacea) (Goosen et al. 1997). Sebagian besar kitosan untuk penggunaan komersial dan penelitian diproduksi dari deasetilasi kitin yang berasal dari kulit udang dan kepiting, limbah utama pada industri pengolahan shellfish. Secara alami kitosan dapat dihasilkan dari fungi golongan zygomycetes (Miyoshi et al. 1992). Kitosan adalah polimer alami, sehingga tidak bersifat toksik, tidak larut dalam air yang bersifat basa tetapi larut baik dalam pelarut asam di bawah pH 6. Aplikasi polimer kitosan tidak sebanyak bentuk kitooligomernya, hal ini disebabkan karena kitosan memiliki berat molekul yang besar dan viskositas yang tinggi.
Untuk memperoleh kitosan dari kitin dapat dilakukan secara kimia dan enzimatis. Kedua reaksi tersebut bertujuan untuk menghilangkan gugus asetil yang terdapat pada kitin. Reaksi enzimatis menggunakan enzim kitin deasetilase, sedangkan untuk memperoleh kitosan secara kimia dari kitin dapat melalui kombinasi perlakuan panas (60 o
C – 140 o
C) dan larutan alkali (larutan NaOH 30% – 50%). Derajat deasetilasi kitosan biasanya berada antara 70% - 90% tergantung metoda yang digunakan (Goosen et al. 1997). Derajat deasetilasi dipengaruhi oleh konsentrasi basa, temperatur dan rasio kitin terlarut, derajat deasetilasi akan meningkat dengan meningkatnya temperatur atau konsentrasi NaOH (Chang et al. 1997). Proses deasetilasi secara termokimia tersebut dalam banyak hal tidak menguntungkan karena tidak ramah lingkungan, prosesnya tidak mudah dikendalikan, dan kitosan yang dihasilkan memiliki berat molekul dan derajat deasetilasi yang tidak seragam (Chang et al. 1997; Tsigos et al.
2000). Proses deasetilasi yang menggunakan kombinasi perlakuan secara kimiawi dan enzimatis seperti yang telah dilakukan oleh Rochima (2005) merupakan alternatif proses yang lebih baik. Jalur degradatif kitin menjadi kitosan dapat dilihat pada Gambar 1, sedangkan struktur molekul kitin dan kitosan dapat dilihat pada Gambar 2.
Kitin deasetilase (EC 3.5.1.4) Kitin Kitosan Kitinase (E.C 3.2.1.14) Lysozyme Kitosanase (E.C 3.2.1.17) (EC 3.2.1.132)
Kitin oligosakarida Kitosan oligosakarida N-acetil-β-D-
glukosamidase D- glukosamidase
(EC 3.2.1.30)
N-Asetil – D- Glukosamin D-Glukosamin
Gambar 1 Jalur degradasi kitin (Goosen 1997)
Gambar 2 Struktur molekul kitin dan kitosan (Li et al. 1997)
Proses pengubahan kitin menjadi turunan oligosakarida secara kimiawi oleh asam cenderung dihindari karena proses ini tidak dapat dikontrol, menghasilkan lebih banyak monomer D-glukosamin dan lebih sedikit kitooligomer, padahal, yang memiliki aktivitas biologi penting adalah senyawa- senyawa kitooligomernya (Kolodziesjka et al. 2000, Curroto & Aros 1993). Hidrolisis kitosan secara enzimatis adalah cara yang lebih baik untuk mendapatkan senyawa-senyawa kitooligomer dengan derajat polimerisasi yang
lebih rendah, karena sifat fungsional bergantung pada berat molekulnya (Suzuki 1996, Kolodziejska et al. 2000).
Banyak studi yang telah dilakukan mengenai penggunaan enzim untuk mendegradasi kitosan. Aiba (1993,1994) menghidrolisis kitosan menggunakan enzim kitinase dan lisozim. Pantaleone et al. (1992) dan Brine et al. (1992) melaporkan penggunaan enzim glikanase, protease, lipase, dan tannase yang berasal dari bakteri, fungi, mamalia, dan tanaman untuk menghidrolisis kitosan. Muzarelli et al. (1995a, 1995b) telah menggunakan enzim papain dan lipase untuk depolimerisasi kitosan. Guo dan Hung (2002) melaporkan penggunaan enzim selulase untuk memperoleh senyawa -senyawa kitooligosakarida dari kitosan. Berbagai proses tersebut dikembangkan untuk menghasilkan proses hidrolisis yang efisien terhadap kitosan, akan tetapi penggunaan enzim-enzim tersebut membutuhkan konsentrasi yang relatif tinggi, sedangkan kitosanase menunjukkan aktivitas yang cukup baik pada konsentrasi yang kecil (Jeon dan Kim 2000).
Telah banyak dilaporkan adanya sifat fisiologis penting senyawa-senyawa kitooligo mer hasil degradasi kitin dan kitosan, yang memiliki daya antibakteri, antijamur, antitumor, penurun kolesterol, penurun tekanan darah tinggi, dan kemampuannya dalam meningkatkan daya imunologis (Dalwoo 2004, Muzarelli 1996, Shahidi et al.1999, Suzuki et al. 1986, Suzuki 1996). Dalam bidang farmasi, kitooligomer mampu menurunkan kolesterol. Aktivitas hipokolesterolemik kitooligomer kemungkinan disebabkan karena penghambatan pembentukan
micelle yang mengandung kolesterol, asam lemak dan monogliserida, sehingga berperan aktif sebagai anti kolesterol (Goosen 1997, Dodane dan Vilivalam 1998). Cui dan Mumper (2001) meneliti tentang penggunaan kitosan dan oligomernya untuk berkompleks dengan CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) guna membentuk kationik nano patrikel yang stabil untuk keperluan imunisasi genetik. Kemampuan kitosan dan senyawa-senyawa kitooligomer sebagai antimikroba telah diujikan pada organisme penghasil spora pada media laboratorium dan makanan, ternyata Kitooligomer yang lebih pendek lebih efektif berperan sebagai antimikroba daripada yang berantai panjang (Shahidi et al. 1999 ; Rhoades dan Roller 2000 ; Meidina 2005 ).
Pada Tabel 1 disajikan informasi penelitian yang telah dilakukan untuk memperoleh senyawa-senyawa kitooligo mer yang berasal dari kitin dan kitosan
Tabel 1 Beberapa penelitian produksi senyawa-senyawa kitooligo mer
N o
Enzim Sumber Aktivitas Metode Substrat & konsentrasi Hasil Referensi 1. Kitosanase Bacillus pumilus BN-262 (45oC) 5,10,15 dan 25 U/g Chit UFmembran reaktor Kitosan terlarut 1% (DD 89%) Trimer - Heksamer
Jeon & Kim 2000 2. Kitosanase Bacillus sp BN-262 (50oC) 1g/100ml (13% prot) Imobilisasi pada suport gel agar Kitosan terlarut 0,5% (DD 100%) Pentamer & Heksamer Ichikawa et al. 2002 3. Kitinase Streptomyc es cursanovii (37oC) 0,38U/ml Imobilisasi pada macroporous cross linked chitin Kitin koloidal 1% (DD 85%) Dimer - Nanomer Ilyina et al. 2000 4. Lisozim & lateks pepaya Degradasi re - dox H2O2 & Fe(III) Kitosan hidrokhlorid a 1% (DD 15,6%) Rhoades & Roller 2000 5. Kitosanase Bacillus sp Strain CK4 (60oC) 0,1mg/ ml Purifikasi dengan DEAE Toyopear l650-M Kitosan koloidal l% (DD 100%) Monomer - Heksamer Yoon et al. 2001 6. Kitosanase Bacillus sp Strain KCTC 0377BP (40oC) 2-8 U/g Inkubasi enzim dan substrat selama 24 jam. (Direct enzymatic reaction) Kitosan terlarut 20 - 40 mg/ml (DD 39, 50 dan 72 %) Trimer - Heptamer Yeon et al. 2004
Senyawa-senyawa kitooligomer dilaporkan memiliki aktivitas anti kanker, laporan ini antara lain dikemukakan oleh Ye on (2004) bahwa heksa N-asetil kitoheksaose dan kitoheksaose memiliki pengaruh penghambat pertumbuhan dari sel tumor Meth A-solid. Semenuk et al. (2001) melaporkan aktivitas kitooligomer sebagai anti tumor melalui kemampuan senyawa kitooligomer bertindak sebagai ligan bagi reseptor sel natural killer yang mengakibatkan aktivasi selular sistim imun sehingga kitooligomer tersebut dapat berfungsi sebagai anti tumor. Pae et al.(2001) melaporkan terjadinya penghambatan pada sel promyelocytic leukemia (HL-60) oleh water-soluble chitosan oligomer (WSCO). Shen (2002) juga melaporkan kitosan larut air (WSC) secara signifikan menghambat proliferasi sel kanker ASG. Guo & Hung (2002) melaporkan senyawa kitooligosakarida yang dihasilkan dari enzim selulase memiliki pengaruh pada fungsi sistim imun seperti mempengaruhi proliferasi sel makrofag dan hibridoma HB4C5 secara in vitro. Sedangkan secara in vivo terbukti meningkatkan kandungan IgG dan IgM dalam serum darah mencit yang diinjeksi dengan N- asetil kitoheksaose.
2. Kitosanase dan Mikroba Penghasil Kitosanase
Kitosanase (EC 3.2.1.132) merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan glikosidik kitosan untuk menghasilkan kitooligomer (kitooligosakarida). Kitosan ( â-(1 4)-N-glukosamin) merupakan turunan dari kitin yang diperoleh melalui deasetilasi sempurna atau sebagian. Menurut Fukamizo dan Brzezinski (1997), kitosanase adalah enzim yang menghidrolisis kitosan, memotong pada ikatan â- 1,4-glikosidik kecuali ikatan GlcNAc-GlcNAc. Kitosanase dibagi menjadi tiga klas berdasarkan spesifik pemotongannya yaitu klas 1, enzim memotong pada ikatan GlcN-GlcN dan GlcNAc-GlcN; klas 2, enzim yang memotong hanya pada ikatan GlcN-GlcN; klas 3, enzim yang memotong pada ikatan GlcN-GlcN dan GlcN- GlcNAc (Saito et al. 1999; Fukamizo dan Brzezinski 1997). Pada Tabel 2 disajikan beberapa karakteristik enzim kitosanase dari berbagai sumber.
Berdasarkan homologi sekuen asam amino, Yoon et al. (2000) mengkategorikan kitosanase ke dalam empat kelompok, kelompok I berhubungan erat dengan kitosanase dari B. circulans, B.ehemensis, dan
Burkholderia gladioli (similaritas sekitar 81-84%). Kelompok II termasuk
Amycolaptosis sp., Nocardioides sp. N 106, Streptomyces sp. N 174 (similaritas sekitar 73-76%). Bacillus sp. CK4 dan Bacillus subtilis termasuk dalam golongan kelompok III dengan similaritas sekitar 76.6%. Sedangkan Sphingobacterium dan
Matsuebacter digolongkan ke dalam kelompok IV dengan similaritas sekitar 75%.
Carbohydrate Active Enzyme (CAZY) mengklasifikasi kitosanase pada 3 (tiga) kelompok, yaitu family 46, 75 dan 80. Sebagian besar hasil studi kitosanase yang terdapat pada bakteri termasuk dalam anggota glikosida hidrolase family 46, dimana kitosanase dari fungi patogen tanaman seperti Fusarium solani
diklasifikasi sebagai glikosida hidrolase family 75. Chitosanotabidus dan
Sphingobacterium multivorum termasuk golongan glikosida hidrolase family 80 (Park et al. 1999). Diantara kitosanase yang telah diteliti tersebut hanya glikosida hidrolase family 46 yang telah ditentukan struktur tiga dimensinya dan hanya dua struktur kristal kitosanase, yaitu dari Streptomyces sp. N174 dan
Bacillus circulans yang telah dipublikasi (Saito et al. 1999). Glu-22 dan Asp-40 merupakan residu asam amino yang penting pada sisi katalitiknya (Fukamizo dan Brzezinski 1997) dimana residu triptofan berperan penting untuk kestabilan protein enzim kitosanase (Honda et al. 1999). Hasil studi lain terhadap identifikasi residu asam amino untuk aktivitas katalitik kitosanase termostabil dari Bacillus
sp. CK4 menunjukkan bahwa Glu-50 tidak mutlak esensial untuk aktivitas katalitik, tetapi mungkin memiliki peranan penting untuk menjaga struktur sisi katalitik kitosanase (Yoon et al. 2001).
Berbagai pertimbangan penggunaan mikroba sebagai sumber enzim kitosanase antara lain adalah mikrob a dapat tumbuh relatif cepat, bahan baku relatif murah, mudah diisolasi, dan terbuka peluang untuk meningkatkan mutu enzim melalui rekayasa genetika (Madigan et al. 2000). Informasi tentang mikroba penghasil enzim kitosanase telah dilaporkan oleh beberapa peneliti, antara lain kitosanase dari Bacillus sp P1-7S dilaporkan oleh Seino et al. (1991),
Matsuebacter chitosanotabidus 3001 oleh Park et al. (1999), Bacillus sp strain CK4 oleh Yoon et al. (2001), Burkholderia gladioli strain CHB101 oleh Shimosaka
et al. (2000), Streptomyces N174 oleh Somashekar dan Joseph (1996). Kitosanase yang berasal dari fungi dilaporkan oleh Shimosaka et al. (1993) yang mengisolasi kitosanase dari Fusarium solani f.sp. dan phaseoli, Cheng dan Li (2000) mengisolasi kitosanase dari Aspergillus Y2K. Kitosanase yang berasal dari tanaman Cucumis sativus, Citrus sinensis, dan Barley telah dilaporkan oleh Somashekar dan Joseph (1996).
Karakteristik enzim kitosanase yang berasal dari Bacillus licheniformis MB2 disajikan dalam Tabel 2. Beberapa karakteristik enzim kitosanase yang berasal dari berbagai sumber disajikan pada Tabel 3.
Tabel 2 Karateristik enzim kitosanase dari Bacillus licheniformis MB2 a)
No. Parameter Karakteristik
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Suhu optimum pH optimum Buffer optimum Berat Molekul Aktivator Spesifitas substrat
Tahan terhadap jenis denaturan 70o C 6.0 -7.0 Buffer phosphat 0.05 M pH 6 75 kDa Mn Kitosan terlarut
Guanidin dan urea a) Chasanah 2004
Tabel 3 Beberapa karakteristik biokimia kitosanase Mikroorganisme Berat Molekul (kDa) pH Optimum Suhu Optimum (oC)
Inhibitor substrat Produk Referensi
Matsuebacter chitosanotabidus 3001 Paenibacillusfukuinensis D2 B. circulans MH-K1 Bacillus sp CK-4 Aspergillus Y2K Acinetobacter sp CHB101 Fusarium solani f.sp phaseoli. 34 86.51 27 29 25 37 & 30 36 4.0 - 6.5 6.5 6.6 5 – 9 5.6 30 – 40 - 50 60 65 – 70 40 40 Ag2+ - Hg2+, Zn+, pCMB, Cu2+ Cu2+ Hg2+,Cd2= - - - Kitosan DD 100%, CMC Kitosan dengan DD tinggi Kitosan dengan DD tinggi Kitosan dengan DD tinggi Kitosan dengan DD tinggi Kitosan dengan DD tinggi Kitosan dengan DD tinggi (GlcN)2-6 (GlcN)2-7 (GlcN)4 (GlcN)4 (GlcN)3-5 (GlcN)3-5 (GlcN)3-5 Park et al. 1999 Kimoto et al. 2002 Yabuki et al. 1988 Yoon et al. 2000 Cheng dan Li (2000) Shimosaka et al. 1995 Shimosaka et al. 1993
B. BAHAN PANGAN SEBAGAI IMMUNOENHANCER DAN ANTIKANKER
Penelitian untuk menunjukkan potensi bahan pangan tertentu yang memiliki aktivitas terhadap proliferasi sel limfosit dan antiproliferasi terhadap sel kanker telah banyak dilakukan. Buah-buahan, sayuran dan biji-bijian merupakan sumber dari produk samping metabolisme senyawa mevalonat yang bersifat antikarsinogenik (Elson dan Yu 1994). Beberapa jenis bahan pangan lain yang juga mengandung senyawa antikarsinogenik adalah: bawang, kol, kedelai, wortel, seledri, bawang bombay, teh hijau, citrus (orange, lemon, grapefruit), beras pecah kulit dan gandum utuh (Caragay 1992). Menurut Waladkhani dan Clemens (1998) sayuran, buah-buahan dan biji -bijian mengandung beragam senyawa fitokimia yang berpotensi sebagai senyawa antikarsinogenik yaitu: karotenoid, klorofil, flavonoid, indol, komponen polifenol, inhibitor protease, sulfida, dan terpen. Laporan tersebut didukung oleh hasil penelitian Zakaria et al. (2000) yang melaporkan bahwa konsumsi sayur dan buah yang mengandung vitamin C dan vitamin E dapat meningkatkan kemampuan proliferasi sel limfosit
dan meningkatkan aktivitas sitotoksik dari sel NK. Selanjutnya Ogata et al.
(2000), melaporkan senyawa turunan asam nikotinat dan nikotinamida yaitu niasin (jenis vitamin larut air) ditemukan tidak membunuh sel limfosit, tetapi dapat menginduksi apoptosis pada sel K562.
Kelompok solanase (tomat, kentang, terung dan cabai) dan rempah-rempah (jahe, cengkeh, kunyit) juga merupakan kelompok bahan pangan yang mempunyai sifat anti karsinogenik. Menurut Yuana (1998), rempah-rempah seperti jahe, lempuyang, kencur dan pasak bumi mempunyai komponen- komponen yang dapat memberikan efek penghambatan terhadap sel kanker K562. Agustinisari (1998) melaporkan bahwa ekstrak air dan etanol jahe segar dapat menekan proliferasi sel leukimia (K562) secara in vitro. Ekstrak air dan etanol dari bawang putih dari hasil penelitian Lastari (1997) dapat menekan proliferasi sel-sel K562 secara in vitro dan menaikkan aktivitas sel NK manusia. Rusmarilin (2003) juga melaporkan aktivitas anti kanker dari ekstrak lengkuas lokal (Alpinia galanga (L) Sw) pada galur sel kanker manusia dan mencit.
Senyawa turunan flavonoid yang terkandung dalam bahan pangan antara lain quersetin memperlihatkan kemampuan menghambat proliferasi sel leukimia dan sel ovari manusia secara in vitro (Zakaria et al. 1997). Iwashita et al. (2000) juga melaporkan aktivitas senyawa isoliquiritigenin dan butein turunan dari flavonoid mampu menghambat pertumbuhan sel dan menginduksi terjadinya apoptosis pada sel-sel B16 Melanoma 4A5. Damayanti (2002) melaporkan senyawa antioksidan dari bekatul padi (Oryza sativa) mampu menekan proliferasi sel kanker KR4 sebesar 30 %, K562 sebesar 12%, dan melanoma sebesar 23%. Beberapa ekstrak tanaman juga dilaporkan memiliki kemampuan memperbaiki sistem imun dan bersifat anti kanker, antara lain hasil penelitian dari Konishi et al. (1985) dan Noda et al. (1996) yang melaporkan aktivitas anti tumor dari chlorella vulgari. Senyawa fenol glikosida, neohankosida C, yang diisolasi dari tanaman Cynanhum hancockianum diketahui bersifat anti tumor dan mempunyai aktivitas imunomodulator (Konda et al. 1997). Eksktrak tanaman
Uncaria tomentosa dilaporkan tidak bersifat toksik (Maria et al; 1997), menginduksi proliferasi limfosit (Wurm et al. 1998) dan mampu menghambat proliferasi serta menginduksi apoptosis sel-sel leukimia K562 dan HL-60 (Sheng
et al. 1998). Meiyanto et al (2003) juga melaporkan ekstrak etanol daun dan kulit batang tanaman cangkring (Erythrina Fusca Lour) dapat menghambat proliferasi
sel HeLa. Ananta (2000) melaporkan ekstrak cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers) mampu menghambat proliferasi sel K562 sebesar 70% dan sel HeLa sebesar 30%. Puspaningrum (2003) melaporkan ekstrak air kayu secang (Caesalpinia sappan Linn) mampu memproliferasi sel limfosit limfa tikus dan menekan proliferasi sel K562 secara in vitro sebesar 20.8%.
Senyawa-senyawa anti kanker ternyata tidak hanya berasal dari daratan, Aoki et al. (2004) melaporkan aktivitas anti kanker dari smenospongine yaitu senyawa aminokuinon seskuiterpen yang diisolasi dari spong laut terhadap sel kanker K562 (chronic myelogenous leukemia) pada konsentrasi 3 – 15 µM. Senyawa kitin dan turunannya yang berasal dari hewan laut udang dan kepiting ternyata juga dilaporkan memiliki aktivitas anti kanker, laporan ini antara lain dikemukakan oleh Yeon (2004) bahwa heksa N-asetil kitoheksaose dan kitoheksaose memiliki pengaruh penghambat pertumbuhan dari sel tumor Meth A-solid. Semenuk et al. (2001) melaporkan aktivitas kitooligomer sebagai anti tumor. Pae et al. (2001) melaporkan terjadinya induksi granulositik pada sel
promyelocyticleukemia (HL-60) oleh water-soluble chitosan oligomer (WSCO). Shen (2002) juga melaporkan kitosan larut air (WSC) secara signifikan menghambat proliferasi sel kanker ASG.
B. LIMFOSIT DALAM SISTEM IMUN
Limfosit adalah sel darah putih (leukosit) yang mampu menghasilkan respon imun spesifik terhadap berbagai jenis antigen yang berbeda. Limfosit (leukosit) berukuran kecil, berbentuk bulat (diameter 7-15 µm), dan banyak terdapat pada organ limfoid seperti seperti limpa, kelenjar limfe dan timus. Terdapat dua kelas leukosit yaitu, yang mengandung granula dalam sitoplasmanya (granulosit) dan agranulosit yang tidak mengandung granula (Ganong 1990). Limfosit merupakan sel kunci dalam proses respons imun spesifik, mengenali antigen melalui reseptor antigen dan mampu membedakannya dari komponen tubuhnya sendiri (Kuby 1992).