4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Teknik Kultur Nannochloropsis oculata
4.2.1 Kultur Nannochloropsis oculata Skala Laboratorium
Dalam kegiatan kultur N. oculata skala Laboratorium terbagi menjadi 2 bagian yaitu Kultur Murni I dan Kultur Murni II. Kegiatan pada Kultur Murni I meliputi penyediaan bibit starter melalui kultur dengan media isolate agar dan kultur tabung reaksi. Sedangkan untuk Kultur Murni II meliputi kegiatan kultur pada Erlenmeyer menggunakan aerasi dan kultur pada Carboy.
4.2.1.1 Kultur Murni I (Monospesies) 1. Sterilisasi Alat dan bahan
Pada dasarnya persiapan untuk kultur berbagai jenis fitoplankton adalah sama, yaitu sterilisasi alat dan bahan yang bertujuan untuk membunuh mikroorganisme yang tidak diinginkan (Cahyaningsih et al, 2009). Pada Skala Laboratorium di BPBAP Situbondo keadaan steril sangat diutamakan karena hasil akhir yang diharapkan adalah monospesies, sehingga perlu dilakukan sterilisasi. Sesuatu yang akan disterilisasi dibersihkan terlebih dahulu atau dicuci.
27
Peralatan seperti petri disk, test tube, erlemeyer, gelas ukur, pipet tetes, dan yang lainnya dicuci terlebih dahulu menggunakan sabun dan dibilas dengan air tawar. Tujuannya adalah agar sisa-sisa kotoran yang ada sebelumnya dapat hilang. Peralatan yang sudah bersih diletakkan di rak-rak, dibiarkan sampai mengering. Kemudian alat – alat tersebut dibilas lagi menggunakan HCL dan dibilas air tawar lagi. Setelah alat-alat tersebut kering kemudian ditutup menggunakan aluminium foil sebagai persiapan untuk di autoclave. Alat-alat yang sudah disterilkan dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Alat – Alat yang sudah di sterilisasi (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2015)
Sterilisasi yang selama ini dilakukan pada kultur murni I untuk sterilisasi bahan yang akan digunakan yaitu dengan menggunakan autoclave. Bahan yaitu media dan pupuk dimasukan dalam erlenmeyer/beakerglass kemudian ditutup dengan alumunium foil dan plastik, lalu diikat dengan karet gelang. Setelah itu dilanjutkan dengan sterilisasi alat secara fisika dengan meggunakan autoclave (Gambar 7.) dengan suhu 1210C dan tekanan 1 atm selama 30 menit. Hal ini sesuai dengan pernyataan Isnansetyo dan Kurniastuti (1995), sterilisasi dengan autoclave pada dasarnya menggunakan uap air bertekanan.
28
Gambar 7. Autoclave (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2015)
2. Kultur Nannochloropsis oculata a) Teknik Isolasi Menggunakan Media Agar
Starter murni di BPBAP Situbondo diperoleh dari alam dan dari lembaga- lembaga penelitian di dalam maupun luar negeri. Selanjutnya diperbanyak dengan membuat kultur pada media agar.
Tahapan teknik isolasi dengan media agar adalah sebagai berikut :
Agar bacto sebanyak 1,5 gram dilarutkan ke dalam air laut yang telah dipupuk dengan salinitas 33 ppt yang sudah steril sebanyak 100 ml.
Kemudian dipanaskan dan diaduk sampai larutan agar mendidih, diangkat dan ditutup dengan aluminium foil. Selanjutnya disterilisasi menggunakan
autoclave.
Media agar yang sudah didisterilisasi dibiarkan sebentar kemudian ditunag ke petridish ¾ bagian. Setelah beku dapat diinokulasi dengan bibit alga menggunakan jarum ose yang sebelumnya disterilisasi dengan dibakar lampu Bunsen sampai merah.
Media agar yang sudah digores dengan bibit, ditutup dan diberi isolasi lalu disimpan di rak dalam ruangan yang dilengkapi pendingin dan lampu. Inokulasi akan berkembang setelah 3-4 minggu.
29 b) Kultur pada Tabung Reaksi
Setelah diperbanyak dengan menggunakan kultur murni pada media agar selanjutnya diperbanyak pada tabung reaksi lainnya. Tahapan dalam kultur tabung reaksi adalah sebagai berikut :
Menyiapkan air yang sudah steril yang sudah dipupuk (pupuk walne dosis 1 ml/L) , tiap tabung reaksi diisi media ¾ bagian sebanyak 25 ml
Air yang sudah steril diberi pupuk dituang hingga setengah bagian tabung reaksi. Pupuk yang digunakan yaitu pupuk walne. Dosis pupuk yang digunakan adalah 1:1 dengan media kultur, maka pupuk yng digunakan sebanyak 25 ml.
Starter diambil dari kultur media agar yang sudah mencapai puncak pertumbuhannya, starter diambil dengan jarum ose yang sudah dipanaskan diatas bunsen untuk sterilisasi dan diinokulasi ke media secukupnya. Kultur pada tabung reaksi baru dapat dipindahkan ke kultur toples tanpa
aerasi setelah berumur satu hingga dua minggu. Untuk kultur fitoplankton dalam ruang kultur murni I (monospesies) semua dilakukan tanpa aerasi. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan pertumbuhan yang natural dari fitoplankton yang dikultur.
4.2.1.2 Kultur Murni II 1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu alat atau bahan bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan (Isnansetyo dan Kurniastuti, 1995). Sterilisasi yang dilakukan pada ruang kultur murni II untuk peralatan seperti wadah toples, carboy, selang aerasi, batu aerasi, dan lain-lain dilakukan dengan pencucian dengan sabun sampai bersih. Kemudian untuk
30
carboit, selang dan batu aerasi setelah dicuci dilakukan perendaman dengan kaporit yang bertujuan membunuh sisa plankton setelah kegiatan kultur.
Sterilisasi media kultur murni II terbagi menjadi dua untuk kultur pada Erlenmeyer menggunakan aerasi dan untuk carboy. Untuk media Erlenmeyer menggunakan aerasi sterilisasi dilkukan dengan perebusan air laut hingga mendidih. Lalu air yang sudah mendidih langsung dimasukan dalam erlenmeyer yang akan dikultur. Sedang sterilisasi media untuk carboy dilakukan dengan pemberian kaporit dengan dosis 10 ppm pada tandon air laut dalam ruang kultur murni II. Pemberian kaporit bertujuan untuk mensterilkan air dari mikroorganisme yang merugikan sehingga diharapkan tidak terjadi kontaminasi. Selanjutnya air diberi Na-Thiosulfat sebagai penetralisir kandungan kaporit dengan dosis 5 ppm. 2. Kultur Nannochloropsis oculata
a) Kultur Erlenmeyer menggunakan aerasi
Wadah kultur yang telah berisi air laut steril diberi aerasi dan dipupuk (Walne dosisi 1 ml/L) kemudian diberi stater sebanyak 20-30 %. Inkubasi dilakukan pada suhu 200C dengan lampu TL 40 watt. . Pupuk yang digunakan adalah pupuk walne. Kultur N. oculata dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Kultur Nannochloropsis oculata dalam Erlenmeyer menggunakan aerasi (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2015)
31
Tahapan yang dilakukan dalam kultur Erlenmeyer 5 L adalah sebagai berikut: Rak yang akan digunakan untuk erlenmeyer dibersihkan dahulu dengan
menggunakan alkohol untuk menghindari kontaminasi.
Erlenmeyer diisi air media sebanyak 3-4 L dengan salinitas 33 ppt. Kemudian dilakukan penetralan dengan Na-Thiosulfat 5 ppm, untuk
mengecek apakan netral atau belum, gunakan Chlorine tes untuk memastikan bahwa air sudah netral.
Kemudian diberi pupuk walne dan vitamin B12 dengan dosis 1ml/L air media.
Starter atau bibit N. oculata didapatkan dari ruang kultur murni I dimasukkan ke dalam Erlenmeyer menggunakan aerasi sebesar 20-30% dari wadah.
Kemudian Erlenmeyer menggunakan aerasi ditutup dengan plastik untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi.
Untuk kultur yang didapat langsung dari kultur murni I di beri label dengan tanda bintang, yang menandai bibit yang digunakan masih F1. Sedang bibit yang diperoleh biakan dalam toples (F2), hanya ditulis nama spesies dan tanggal.
Setelah 6-7 hari N. oculata dapat dipindahkan ke kultur carboy.
Hal ini sesuai dengan penelitian Bambang (2009), yang menyebutkan bahwa pada hari kultur ke 7 kultur mengalami perubahan warna dari hijau bening menjadi hijau pekat. Setelah sampai 7 hari dipecah lagi ke volume yang lebih besar.
b) Kultur pada Carboy
Pada tahap ini tempat kultur berupa carboit 10 L. Inkubasi dilakukan pada suhu 200C dengan lampu TL 40 watt. Untuk kultur N. oculata menggunakan air
32
laut yang sudah steril dengan kaporit 10 ppm. Pupuk yang digunakan adalah pupuk walne. Kultur N. oculata dapat dilihat pada Gambar 10.
Tahapan kegiatan kultur pada carboy 10 L adalah sebagai berikut:
Langkah awal yaitu menyiapkan carboy dan selang aerasi yang akan digunakan.
Kemudian masukkan air yang telah netral dari tandon air ke dalam carboy sebanyak 7-8 L dan letakan carboy pada rak kultur yang tersedia dalam ruang kultur murni II.
Selanjutnya tambahkan pupuk walne dan vitamin B12 dengan dosis 1ml/L.
Starter atau bibit N. oculata didapat dari Erlenmeyer menggunakan aerasi ruang kultur murni II dimasukkan ke carboy sebanyak 20-30%. Kemudian carboy ditutup untuk menjaga agar tidak terjadi kontaminasi. Setelah 6-7 hari N. oculata dapat dipindahkan ke kultur skala
Intermediate.
33
Kegiatan kultur skala laboraturium yang dijalankan pada Lab. Pakan Alami BPBAP Situbondo telah sesuai dengan pendapat Isnansetyo dan Kusniastuty (1995), yang menyatakan bahwa kultur skala laboratorium dimulai dari volume 0,5 sampai 3 dan 5 liter. Air laut dengan salinitas tertentu dimasukkan ke dalam wadah. Air laut yang dimasukkan terlebih dahulu disterilkan sebelum inokulum dimasukkan sebanyak 1/3 bagian, media kultur dipupuk terlebih dahulu. Setelah diberi aerasi dan kultur diletakkan pada rak kultur dengan pencahayaan lampu TL.
4.2.1.3 Pupuk Kultur Skala Laboratorium
Pupuk diberikan untuk memenuhi kebutuhan unsur hara bagi pertumbuhan plankton. Jenis pupuk yang digunakan adalah pupuk media walne. Pada skala laboratorium pupuk yang digunakan adalah tingkat “Pro Analyse” atau yang biasa disebut dengan PA. Pupuk dengan tingkat “Pro Analyse” ini sangat baik bagi pertumbuhan fitoplankton karena pupuk ini tidak terdapat campuran – campuran bahan lain. Komposisi nutrien yang lengkap dan konsentrasi nutrien yang tepat menentukan produksi biomassa dan kandungan gizi mikroalga. Jenis pupuk yang banyak dipilih masyarakat dalam kultur mikroalga adalah jenis PA (Pro Analisis) yang sudah distandarkan seperti pupuk Walne, Guillard, dll (Amanatin, et al., 2014)
Proses pembuatan pupuk walne untuk skala laboraturium dilakukan dengan cara merebus air tawar hingga mendidih menggunakan kompor listrik, kemudian setelah mendidih bahan diatas dimasukan satu-persatu kecuali FeCl3. Untuk memasukan FeCl3 dalam panci perubusan dilakukan penngenceran terlebih dahulu dengan cara mengabil sebagian air yang sedang direbus dalam beakerglas lalu masukan FeCl3 dalam beakerglas tersebut dan aduk merata.
34
Setelah itu barulah larutan FeCl3 dalam beakerglas dimasukan dalam panci perebusan dan diaduk hingga merata.
Komposisi pupuk Walne untuk skala laboratorium dapat dilihat pada Tabel 2. sebagai berikut :
Tabel 2. Bahan Pupuk Walne untuk Skala Laboratorium.
Bahan Dosis Aquades 1 ltr EDTA 45 gr NaNO3 100 gr H3BO3 33,6 gr NaH2PO4 20 gr MnCl 0,36 gr FeCl3 1,3 gr