BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
E. Validasi Metode Analisis
1. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode menggambarkan seberapa baik
kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linearitas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh berupa nilai kemiringan (slope), intersep,
dan koefisien korelasi (Gandjar dan Rohman, 2007). 2. Kisaran (Range)
Kisaran atau range suatu metode merupakan interval konsentrasi analit
terendah dan tertinggi dalam suatu sampel yang mana telah memenuhi linearitas, presisi dan akurasi dalam suatu metode. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama, maka konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan (Gandjar dan Rohman, 2007).
3. Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya dapat dilihat sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007).
Menurut ICH, presisi dikategorikan menjadi 3 tingkatan yang berbeda yaitu repeatibility, intermediate precision dan reproducibility.Repeatibility yaitu
ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik
orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Analisis Repeatibility
dapat dilakukan dengan membuat tiga konsentrasi yang berbeda-beda dengan tiga kali replikasi masing-masing konsentrasi.Intermediate precision yaitu ketepatan
tempatnya, maupun waktunya.Reproducibilitymenggambarkanpresisi yang
diperolehantarlaboratorium(Chan,Lam, Lee dan Zhang, 2004).
Presisi mencakup simpangan baku, simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV), dan kisaran kepercayaan. Pengujian presisi pada validasi metode sebagian besar menggunakan repeatibility dan intermediate precision.
Reproducibility biasanya dilakukan untuk membandingkan hasil uji antar
laboratorium. Presisi dapat dihitung menggunakan rumus :
% 100%
Dimana SD merupakan standar deviasi serangkaian data dan mean merupakan
rata-rata data(Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Akurasi
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian
bahan obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan
standard reference. Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan
pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data yang diperoleh dinyatakan sebagai persentase perolehan kembali(Chan,Lam, Lee dan Zhang, 2004).
5. Limit of Detection (LOD)
LOD merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. LOD dapat dihitung secara statistic melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. LOD dapat dihitung menggunakan rumus :
b Sa
LOD 3,3 (Ermer and Miller, 2005).
LOD seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada signal to noise
ratio, rasio yang digunakan biasanya 2 atau 3 dibanding 1. ICH mengenalkan
suatu konvensi metode signal to noise ini, dan dua metode pilihan lain untuk
menentukan LOD, yaitu metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan pada metode titrimetri. LOD juga dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope) kurva baku pada level yang
mendekati LOD sesuai dengan rumus. Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007).
6. Limit of Quantitation (LOQ)
LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada signal to noise ratio, rasio yang digunakan
merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang lebih tinggi harus dilaporkan(GandjardanRohman, 2007).
ICH mengenalkan suatu konvensi metode signal to noise ini, dan dua metode pilihan lain untuk menentukan LOQ, yaitu metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. LOQ dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope) kurva baku sesuai dengan rumus.
Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007).
LOQ dapat dihitung secara statistic melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. LOQ dapat dihitung menggunakan rumus :
b Sa
LOQ 3,3 (Ermer and Miller, 2005).
G. Landasan Teori
Kapsul cacing obat merupakan obat bahan alam yang dipercaya berkhasiat mengobati penyakit tifus, diare, berkhasiat sebagai antibakteri dan antipiretik (Dina, 2012) serta mengobati stroke dan thrombosis (Verma dan Pulicherla, 2011). Kapsul cacing obat mengandung cacing tanah kering
Lumbricus rubellus. Sediaan ini dikhawatirkan tercemar logam berat seperti
khusus. Apabila pangan yang diberikan diambil dengan sembarangan misalnya dari pinggir jalan maka akan ada kemungkinan terdapat cemaran logam berat salah satunya timbal.
Penggunaan cacing tanah kering sebagai obat biasanya dikemas dalam bentuk kapsul. Kapsul cacing obata dalah bentuk sediaan obat terbungkus cangkang kapsul, yang berisi obat kering (cacing kering). Sediaan kapsul cacing obat yang dianalisis adalah produk yang tidak memiliki izin BPOM/tanpa merek dan yang memiliki izin BPOM/bermerek.
Keberadaan timbale ini dapat dideteksi dengan menggunakan instrument spektrofotometri serapan atom. Dimana instrument ini bias dengan spesifik mendeteksi keberadaan timbale meski ada logam-logam lain yang dapat mengganggu dari pembacaan alat ini (Beaty and Kerber, 1993). Destruksi yang dipilih adalah destruksi basah karena keamanan dari pengerjaannya terjamin dengan pelarut yang digunakan untuk destruksi adalah H2SO4 dan HNO3 (Christian, 2004). Untuk mendapatkan hasil yang optimal maka perlu dilakukan optimasi sistem SSA. Optimasi yang dilakukan antara lain optimasi tinggi burner dan optimasi untuk perbandingan bahan bakar dan udara. Selain itu juga perlu dilakukan validasi metode agar hasil yang nantinya didapatkan valid.
H. Hipotesis
1. Metode penetapan kadar logam berat timbal pada sediaan kapsul cacing obat menggunakan SSA memiliki validitas yang baik.
2. Terdapat cemaran logam berat timbal pada kapsul cacing obat yang berasal dari salah satu toko obat di Yogyakarta.
Gambar 1. Bagan Hipotesis Timbal (Pb) Cacing Lumbricus rubellus (Chua, 2013) Kapsul Cacing Obat Cemaran Logam Berat Timbal Tidak Terdapat Cemaran Logam Berat Timbal Hipotesis Pangan Cacing Lumbricus rubellus (Endrastiana,2013)
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental dengan rancangan acak.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Klasifikasi variabel
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kadar seri larutan baku Pb(NO3)2, tinggi burner, perbandingan bahan bakar dan udara.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah aborbansi dari seri larutan baku Pb(NO3)2, absorbansi dari sampel kapsul cacing obat dan parameter optimasi serta parameter validasi yang dihasilkan.
c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini yaitu kualitas bahan baku, pelarut dan sampel kapsul cacing obat yang digunakan.
2. Definisi operasional
a. Kapsul cacing obat adalah bentuk sediaan obat terbungkus cangkang kapsul, yang berisi obat kering (cacing kering). Sediaan kapsul cacing obat yang dianalisis adalah produk yang tidak memiliki izin BPOM dan tidak bermerek serta produk yang memiliki izin BPOM dan bermerek.
b. Cemaran logam berat adalah cemaran logam berat timbal pada kapsul cacing obat yang diukur dengan spektrofotometri serapan atom dan dinyatakan dalam ppm (part per million). Dalam penelitian ini ppm yaitu µg/g.
c. Spektrofotometri serapan atom adalah spektrofotometri yang berprinsip pada absorbsi cahaya oleh atom. Atom-atom menyerap cahaya tersebut pada panjang gelombang tertentu, tergantung pada sifat unsurnya. Pada penelitian ini dianalisis logam berat timbal pada resonance lines 283,3 nm.
C. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sampel sediaan kapsul cacing obat yang berasal dari salah satu toko obat di Yogyakarta, asam bikromat 1% teknis (Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), Pb(NO3)2 p.a Merck®, H2SO4 p.a. Merck®, HNO3 p.a. Merck®, aquabidest (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma).
D. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas merek Pyrex®, hotplate merek LabTech®, seperangkat instrumen SSA merek
Perkin Elmer ® dengan tipe nyala udara : asetilen, neraca analitik dengan kepekaan 0,001 (Ohaus Carat Series PAJ 1003) dan kertas Whatman No.42.
E. Tata Cara Penelitian 1. Pengumpulan sediaan kapsul cacing obat
Sediaan kapsul cacing obat diperoleh dari salah satu toko obat di Yogyakarta. Sampel yang digunakan merupakan sampel dengan kode produksi sama kemudian dilakukan uji keseragaman bobot.
2. Uji keseragaman bobot kapsul
Ditimbang 20 kapsul, kemudian ditimbang lagi kapsul satu persatu. Semua isi kapsul dikeluarkan, kemudian ditimbang seluruh bagian cangkang kapsul. Dihitung bobot isi kapsul dan bobot rata-rata tiap isi kapsul. Perbedaan dalam persen bobot isi tiap kapsul terhadap bobot rata-rata tiap isi kapsul tidak boleh lebih dari yang ditetapkan kolom A dan untuk setiap 2 kapsul tidak lebih dari yang ditetapkan kolom B (Dirjen POM, 1979).
3. Penimbangan bobot kering sampel
Wadah dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC selama 1 jam, ditimbang kemudian dipanaskan kembali dalam oven pada suhu 105oC selama 1 jam. Cara ini dilakukan berulang kali sampai diperoleh bobot tetap. Bobot tetap berarti selisih dua kali penimbangan sampel berturut-turut tidak lebih dari 0,5 mg tiap g sisa yang ditimbang. Penimbangan bobot kering juga dilakukan terhadap sampel yang digunakan. Ditimbang 1-2 g sampel kemudian lakukan seperti prosedur diatas menggunakan wadah yang telah dikuantifikasi (Dirjen POM, 1974).
4. Pencucian alat-alat gelas
Alat-alat gelas yang akan digunakan untuk analisis, dibilas dengan asam bikromat 1% dan H2SO4 kemudian didiamkan pada lemari asam selama 24 jam lalu dibilas dengan aquabidest. Setelah kering, alat ini dimasukkan dalam kantong
plastik dan disimpan dalam ruang bebas debu. Sebelum digunakan, peralatan dibilas dengan HNO3 1 M terlebih dahulu (AOAC, 2007).
5. Preparasi cuplikan sediaan kapsul cacing obat
a. Destruksi Basah (Wet Ashing). Ditimbang seksama 2,5 gram sampel
(bobot kering) dalam labu Erlenmeyer 50 mL (sebelumnya dicuci asam dan dikeringkan). Ditambahkan 7,5 mL H2SO4 pekat diikuti oleh 12,5 mL HNO3 pekat ke dalam erlenmeyer. Sampel dipanaskan di hot plate pada suhu ±130°C
(mendidih). Asap cokelat-kuning akan muncul. Setelah asap cokelat-kuning tersebut hilang, maka akan mucul asap putih dari H2SO4. Hal ini menunjukkan proses penguraian H2SO4 dan sampel akan berwarna lebih gelap. Dengan segera erlenmeyer dipindahkan dari pemanas dan perlahan-lahan ditambahkan HNO3 pekat sedikit demi sedikit (catatan: suhu cairan dalam erlemenyer tidak boleh turun hingga sama dengan suhu kamar). Erlenmeyer diletakkan kembali pada pemanas dan HNO3 dididihkan lagi. Dilanjutkan sampai warna larutan menjadi jernih, yaitu berwarna kuning jerami. Jika larutan itu masih gelap warnanya ditambahkan HNO3 pekat kembali dan dididihkan lagi. Proses ini diulangi sampai larutan tersebut jernih, kuning jerami dan ketika dimasukkan kedalam wadah yang berisi es tidak terbentuk gumpalan minyak. Sampel dibiarkan mendingin sampai suhu kamar (dilakukan tiga kali replikasi) (AOAC, 2007).
b. Penyaringan. Penyaringan dilakukan dengan menggunakan corong burner dan kertas Whatman No.42. Kertas saring dijenuhkan dengan HNO3 1 M lalu diletakkan di bagian dalam corong. Corong diletakkan pada mulut labu hisap yang sudah terhubung dengan vaccum. Sebanyak 5 mL HNO3 1 M dituangkan ke dalam erlenmeyer yang berisi timbal hasil destruksi basah kemudian saring. Prosedur ini dilakukan sebanyak tiga kali hingga tidak ada sampel yang tertinggal di Erlenmeyer. Sebanyak 5 mL HNO3 1 M dituangkan melewati kertas saring tadi untuk mengantisipasi adanya sampel yang tertinggal di kertas saring dan corong. Lalu HNO3 1 M ditambahkan hingga batas tanda pada labu ukur 50 mL. Labu ukur ditutup, lalu dikocok dan dipindahkan ke wadah plastik. Larutan siap diujikan ke SSA pada kondisi optimum (dilakukan tiga kali replikasi) (AOAC, 2007).
6. Optimasi metode analisis
a. Optimasi Tinggi Burner. Tekanan bahan bakar dan gas pembawa
diatur sampai nyala api stokiometrik nyala berwarna kuning tipis. Tekanan dinaikkan sampai nyala berpijar kuning kuat. Larutan Pb 5 ppm disiapkan dan absorbansinya dicatat pada 283,3 nm dan λ diatur hingga absorbansi maksimum. Tinggi burner diatur hingga cahaya tampak melalui ujungnya dengan tombol.
Aquabidest digunakan untuk autozero instrumen lalu diukur absorbansi dari
larutan Pb 5 ppm. Tinggi burner diturunkan secara bertahap dan absorbansinya
b. Optimasi untuk Perbandingan Bahan Bakar dan Udara. Digunakan tipe nyala udara : asetilen dengan perbandingan 20:5 dan 20:10. Tekanan udara dijaga konstan dan tekanan bahan bakar diatur bertahap dari kaya bahan bakar hingga nyala kecil. Absorbansi Pb 5 ppm dicatat pada setiap penambahan. Tekanan bahan bakar dipilih yang optimum dan tekanan udara diubah dengan cara yang sama. Absorbansi vs tekanan udara diplot, dengan catatan satu dibuat konstan. Setting tekanan bahan bakar dipilih yang optimum.
7. Pembuatan larutan baku timbal (Pb)
a. Larutan Stok (1000 µg/mL). Dilarutkan 0,3197 g Pb(NO3)2 dalam 50 mL HNO3 1M dalam labu takar 200 mL, kemudian ditambahkan HNO3 1M hingga batas tanda pada labu. Konsentrasi 1000 µg/mL didapat dari:
207,2
331,2098 0,3197 /200 999,9982 μ /
b. Larutan Kerja. Disiapkan Pb 100 µg/mL (intermediet) dengan mengencerkan 10 mL larutan stok hingga 100 mL dengan larutan HNO3 1M. Kemudian dibuat seri kurva baku yaitu 0,1 ; 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 dan 3,0 µg/mL dari larutan intermediet. Kurva kalibrasi unsur Pb diperoleh dengan mengukur serapan larutan standar unsur pada kondisi optimum. Kurva kalibrasi diperoleh dengan membuat kurva antara konsentrasi terhadap serapan Pb.
8. Validasi metode analisis
Validasi metode analisis yang dilakukan meliputi presisi, recovery,
pengaruh prosedur analisis terhadap sampel dan Limit of Quantitation (LOQ).
Prosedur dari parameter-parameter tersebut adalah sebagai berikut : dibuat larutan blangko yang berisi 2,5 g sampel kapsul cacing obat kemudian didestruksi dan dilakukan penyaringan (seperti pada prosedur 5a dan 5b). Kemudian sebelum proses destruksi ke dalam 2,5 g sampel ditambahkan 10 mL larutan standar Pb(NO3)2 p.a dengan konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm dan 10 ppm. Setelah didestruksi kemudian disaring dengan kertas Whatman no.42 dan diukur absorbansinya menggunakan SSA pada kondisi optimum dengan resonance lines
283,3 nm. Dilakukan tiga kali replikasi.
9. Penetapan kadar logam berat timbal pada sediaan kapsul cacing obat Larutan sampel hasil destruksi dan penyaringan diambil kemudian diencerkan dalam labu ukur 50 mL, setelah itu diukur absorbansinya menggunakan SSA dengan kondisi optimum pada resonance lines 283,3 nm.
F. Analisis Hasil
1. Analisis hasil seri kurva baku atau validasi instrumen : a. Korelasi signal/linearitas
Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari persamaan regresi linear.
b. Sensitivitas/limit of detection LOD dapat dihitung dengan rumus:
3 ,3
Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku, b adalah slope dari kurva baku.
c. Kisaran (Range)
Kisaran diperoleh dengan cara melihat interval konsentrasi terendah dari analit dan konsentrasi tertinggi analit yang telah memenuhi parameter linearitas, presisi dan akurasi yang baik.
2. Analisis hasil dari validasi metode yaitu : a. Akurasi
Perolehan Kembali (recovery) = x 100%
b. Presisi
c. Pengaruh prosedur analisis terhadap sampel
Pengaruh prosedur analisis terhadap sampel dapat dilihat dengan plot kurva baku standar dan kurva baku adisi kemudian kedua kurva tersebut dibandingkan dengan significance tests.
d.Limit of Quantitation
LOQ dapat dihitung dengan rumus: 3,3
Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku adisi, b adalah slope dari kurva baku.
32 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Preparasi Sampel Kapsul Cacing Obat 1. Pemilihan sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini merupakan kapsul cacing obat yang diperoleh dari salah satu toko obat di Yogyakarta. Pengambilan sampel dilakukan secara acak namun sebelumnya dipilih sampel dengan kode produksi yang sama. Hal ini dilakukan untuk menjamin kesamaan kondisi sampel selama satu proses produksi, distribusi dan penyimpanan hingga sebelum dilakukan penetapan kadar cemaran logam berat timbal pada sampel tersebut. Kesamaan kondisi sampel ini diharapkan dapat mencegah keragaman kadar yang akan dihasilkan. Terdapat dua sampel yang digunakan yaitu sampel cacing obat bermerek dan sampel cacing obat tanpa merek. Pada sampel kapsul cacing obat bermerek terdapat no.registrasi dari BPOM, komposisi kapsul cacing obat, aturan pakai dan peringatan. Namun, pada sampel kapsul cacing obat tanpa merek hanya terdapat satu komposisi, yaitu mengandung ekstrak cacing Lumbricus rubellus.
Dari kedua sampel tersebut dapat dibandingkan kadar yang akan dihasilkan. 2. Keseragaman bobot kapsul dan penimbangan bobot kering
Setelah pemilihan sampel dilakukan uji keseragaman bobot kapsul terhadap kapsul cacing obat. Penimbangan bobot kering dilakukan terhadap sampel yang telah diuji keseragaman bobotnya. Penimbangan bobot kering dilakukan terhadap wadah dan sampel yang akan digunakan. Penyimpanan wadah
dan bahan dalam ruangan akan memberikan lembab (air) yang berasal dari udara pada wadah/sampel yang akan digunakan. Karena itu perlu dilakukan penimbangan bobot kering untuk mengetahui bobot yang sebenarnya dari wadah atau sampel yang akan digunakan. Penimbangan bobot kering dilakukan dengan melakukan penimbangan bobot berulang kali hingga diperoleh bobot tetap. Bobot tetap yang dimaksud adalah bobot dengan selisih antara tiap penimbangan tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Prosedur ini dilakukan dengan pemanasan dalam oven selama satu jam dengan suhu 105oC, kemudian didinginkan dalam desikator. Desikator merupakan suatu wadah yang terbuat dari bahan gelas yang kedap udara dan mengandung desikan yang dapat menyerap air. Kadar air dari sampel kapsul cacing obat yaitu sebesar 0,16 %. Setelah didapatkan bobot kering maka selanjutnya dilakukan proses destruksi.
3. Destruksi
Pada tahap preparasi sampel kapsul cacing obat, setelah serbuk ditimbang dalam bobot keringnya dilakukan proses destruksi. Dalam penggunaan instrumen SSA, sampel yang akan dianalisis harus tidak mengandung molekul atau senyawa organik yang dapat menimbulkan jelaga (arang) dan tidak mengandung partikel tidak larut yang dapat menyumbat saluran kapiler instrumen. Karena itu setiap sampel yang akan diukur harus mengalami proses destruksi untuk menghilangkan molekul-molekul organik. Molekul organik yaitu molekul yang secara umum tersusun dari rantai karbon, seperti lemak, protein dan karbohidrat. Penggunaan intrumen SSA melibatkan proses pembakaran pada suhu tinggi agar terjadi atomisasi analit Pb. Apabila masih terdapat molekul organik (mengandung
karbon) yang ikut terbakar dapat menimbulkan noda jelaga (arang) pada instrumen. Noda tersebut dapat terakumulasi dalam instrumen sehingga menyebabkan penyumbatan dan kerusakan pada bagian-bagian di sekitar burner.
Destruksi sampel dilakukan dengan proses oksidasi menggunakan asam pengoksidasi sehingga molekul organik yang ada pada sampel dapat teroksidasi dan berubah menjadi fase gas dalam bentuk karbondioksida dan air. Destruksi merupakan proses penghancuran bahan-bahan organik dalam sampel sehingga ikatan antara senyawa organik dengan logam yang akan dianalisis terputus. Terdapat dua cara destruksi yaitu destruksi basah (wet ashing) dan destruksi
kering (dry ashing). Pada destruksi basah biasanya digunakan kombinasi dari
beberapa pengoksidasi seperti asam nitrat, hidrogen peroksida, asam perklorat dan katalis seperti asam sulfat, sedangkan destruksi kering menggunakan suhu pemanasan yang tinggi.
Dalam penelitian ini digunakan destruksi basah karena untuk unsur dalam konsentrasi rendah akan lebih dapat terbaca dibandingkan dengan destruksi kering yang menggunakan suhu tinggi, pemanasan dengan suhu tinggi dikawatirkan dapat mengakibatkan hilangnya unsur-unsur mikro tertentu. Menurut Palar (2004) pada suhu 550-600°C timbal (Pb) menguap dan dengan oksigen dalam udara membentuk timbal oksida. Saat proses destruksi kering terjadi pemanasan hingga temperatur 500-550 oC, hal tersebut kemungkinan akan mengakibatkan kehilangan Pb (Hseu, 2004). Selain itu pada destruksi kering digunakan wadah yang terbuat dari silika atau porselin karena itu bisa terjadi proses adsorpsi unsur-unsur ke permukaan wadah dan membentuk suatu silika yang tidak dapat
dihancurkan seluruhnya oleh asam. Hal tersebut membuat hasil yang diperoleh menjadi tidak kuantitatif karena banyak unsur logam yang hilang.
Pada proses destruksi ditambahkan 7,5 mL H2SO4 pekat diikuti oleh 12,5 mL HNO3 pekat ke dalam erlenmeyer. Kemudian dipanaskan di hot plate pada
suhu ±130°C, pemanasan dilakukan untuk mempercepat proses oksidasi. Mulainya proses oksidasi akan ditandai dengan munculnya gas kuning kecoklatan dari larutan sampel. Apabila asam nitrat habis menguap ditandai dengan berhenti atau berkurangnya gas kuning kecoklatan yang muncul, dan digantikan gas putih yang menunjukkan adanya penguapan gas SO3 dari asam sulfat. Pada tahap ini, larutan menjadi sangat panas sehingga terjadi penghancuran fragmen-fragmen organik yang tersisa. Bila gas putih telah berhenti, dilakukan penambahan sedikit asam nitrat untuk menjaga suasana oksidasi pada larutan di dalam erlenmeyer. Pemanasan larutan di atas hot plate dilanjutkan sampai warna larutan menjadi
jernih. Jika warna larutan berubah menjadi hitam atau coklat yang menandakan masih terdapat molekul organik pada sampel maka harus ditambahkan asam nitrat kembali. Proses ini diulangi sampai larutan jernih dalam beberapa jam dan penambahan asam nitrat tidak menimbulkan reaksi secara kasat mata pada sampel. Hal tersebut menunjukkan proses destruksi telah berkahir.
Pengoksidasi utama dari penelitian ini adalah HNO3 pekat, digunakan HNO3 karena sifat logam (Pb) larut dalam HNO3. Asam nitrat pekat ditambahkan sedikit demi sedikit karena apabila sekaligus sampel akan meluap. Penambahan