3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret hingga April 2015. Kegiatan penelitian dilaksanakan menggunakan sarana di Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya.
3.2 Materi Penelitian 3.2.1 Bahan penelitian
Sampel yang digunakan adalah cairan yang diambil dari canalis servicalis babi menggunakan swab yang diperoleh dari peternakan babi di Desa Sukapura Kabupaten Probolinggo, yang kemudian disimpan dalam media Amies yang merupakan media transport.
Bahan yang digunakan untuk uji isolasi identifikasi yaitu, Blood Agar (BA), Mac Conkey Agar (MCA), Kliger Iron Agar (KIA), dan Manitol Salt Agar (MSA). Satu set bahan pewarnaan Gram terdiri dari crystal violet, lugol, alkohol 95%, dan air fuschine.
Bahan yang digunakan untuk uji kepekaan antibiotik adalah media Muller
Hinton Agar (MHA), serta Antibiotica disk ang mengandung Gentamycin,
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI 3.2.2 Alat-alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi cotton swab,
vaginoscope, tabung reaksi, cawan petri, ose bulat, ose, pembakar Bunsen, object
glass, cover glass, mikroskop, cotton bud, pinset, kertas label, incubator,
autoclave, kapas dan mistar.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Metode pengambilan sampel penelitian
Pengambilan sampel cairan yang diambil dari canalis servicalis babi menggunakan swab yang diperoleh dari peternakan babi di Desa Sukapura Kabupaten Probolinggo, yang kemudian disimpan dalam media Amies yang merupakan media transport. Sampel kemudian segera dibawa ke Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya untuk dilakukan isolasi dan identifikasi terlebih dahulu.
3.3.2 Persiapan penelitian 3.3.2.1 Sterilisasi
Sterilisasi alat dan bahan bertujuan untuk membunuh semua mikroorganisme, termasuk mikroorganisme berspora. Sterilisasi alat dan bahan pada penelitian ini menggunakan strelisasi panas basah bertekanan dengan autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit. Sterilisasi media dilakukan dalam inkubator selama 24 jam.
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI 3.3.3 Pelaksanaan penelitian
3.3.3.1 Isolasi dan identifikasi bakteri
Sampel swab disimpan dalam media Amies kemudian ditanam pada media
Blood Agar (BA) dan MacConcey Agar (MCA). Setelah inkubasi suhu 37ºC
selama 24 jam diamati pertumbuhan koloni bakteri kemudian dilakukan pengamatan mikroskopis untuk mempelajari bentuk bakteri dengan bantuan pengecatan zat warna menurut metode gram. Hasil pengecatan dapat dilihat dari pembentukan warna biru untuk bakteri gram positif dan merah untuk bakteri gram negatif. Selanjutnya ditanam pada media KIA dan kemudian dilakukan pengujian uji biokimia gula-gula serta uji katalase. Hasil uji biokimia dan uji katalase dicocokan pada Tabel standar bakteri (Lampiran 3.) yang sudah baku untuk menentukan genus atau spesies bakteri (Martadinata, 2000).
3.3.3.2 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengamati morfologi sel bakteri dan mengetahui kemurnian sel bakteri. Pengecatan Gram merupakan salah satu pewarnaan yang paling sering digunakan, yang dikembangkan oleh Christian Gram. Preparat apus bakteri dibuat dengan cara, mencampurkan satu usa biak bakteri dari media BA dan MCA dengan NaCl fisiologis yang telah diteteskan pada gelas obyek, kemudian dibuat apus setipis mungkin, dikeringkan, dan difiksasi di atas lampu spiritus. Preparat apus ditetesi pewarna pertama dengan kristal violet selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, ditetesi lugol selama 1 menit,dicuci dengan air mengalir, kemudian preparat apus dilunturkan dengan alkohol 95% selama 5-10 detik. Selanjutnya alkohol dibuang, preparat dicuci
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI
dengan air mengalir dan diberi pewarna kedua dengan larutan Safranin selama 30 detik. Warna kemudian dibuang dan dibersihkan dengan air mengalir, dikeringkan dan diamati morfologi sel, serta warnanya di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan sebagai Gram positif apabila bakteri bewarna ungu, dan Gram negatif apabila selnya terwarnai merah.
3.3.3.3 Uji Biokimia
Uji Biokimia dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri dari media
MacConcey Agar dan Blood Agar ke dalam media Urea, Citrat, Sulfid Indol
Motility (SIM), Kliger Iron Agar (KIA), Methyl Red (MR), dan fermentasi
karbohidrat (glukosa, sukrosa, manosa, maltosa dan laktosa). Media uji biokimia tersebut di inkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam.
3.3.3.4 Uji Katalase
Uji Katalase dilakukan dengan meneteskan hidrogen peroksida (H2O2 ) 3% pada gelas obyek yang bersih. Biakan dioleskan pada gelas obyek yang sudah ditetesi hidrogen peroksida. Suspensi dicampur secara perlahan menggunakan ose, hasil yang positif ditandai oleh terbentuknya gelembung-gelembung udara (Matadinata, 2000).
3.3.4 Uji kepekaan terhadap antibiotik
Pengujian resistensi antibiotik menggunakan metode difusi, yaitu metode yang sangat tergantung pada kelarutan suatu bahan antibiotik terhadap air. Pengujian ini mengacu pada metode dari Kirby Baver dalam Jackie Reynolds (2012) dari Richland Colloge, Dallas USA. Tahap-tahap yang yang dilakukan adalah menanam bakteri positif penyebab endometritis pada media isolasi. Tahap
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI
selanjutnya adalah pembuatan suspensi bakteri dengan cara mentransfer koloni bakteri dari setiap plate ke dalam 2 ml NaCl fisiologis steril. Kekeruhan suspensi disetarakan dengan Mc. Farland 0,5. Setelah kekeruhan sesuai dengan Mc. Farland 0,5, dilakukan swab pada media plate Muller-Hinton Agar dengan menggunakan cotton buds steril merata keseluruh permukaan media. Siapkan media disk antibiotikyang digunakan yaitu Ampicillin, Gentamicin, Tetracyclin,
Metronidazole dan Ciprofloxacin.
Uji kepekaan antibiotik bertujuan untuk mengetahui sejauh mana kepekaan suatu mikroorganisme terhadap antibiotik tertentu, atau untuk mengetahui sejauhmana potensi antibiotik tertentu terhadap mikroorganisme secara in vitro. Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antibiotik sebagai wilayah jernih (zona hambat) di sekitar pertumbuhan mikroorganisme. Luas wilayah jernih (zona hambatan) merupakan petunjuk mikroorganisme terhadap antibiotik, selain itu luasnya wilayah juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotik dalam media.
3.4 Analisis data
Data yang diperoleh dinyatakan secara deskriptif kualitatif dengan perhitungan dengan mengukur zona hambat untuk mengetahui adanya kepekaan terhadap bahan-bahan antibiotik yang terdiri atas Gentamycin, Tetracyclin,
Metronidazole, Ampicillin, dan Ciprofloxacin yang kemudian ditampilkan dalam
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI 3.5 Kerangka Penelitian
Gambar 3.1. Kerangka penelitian Pembacaan hasil identifikasi bakteri
Uji kepekaan dengan menggunakan 5 macam antibiotik yaitu Ampicillin, Gentamycin,Tetracyclin, Metronidazole
dan Ciprofloxacin
Uji katalase Uji Biokimia Gram Positif Gram Negatif
Pemeriksaan Gram
Pengambilan sampel dengan mengambil cairan menggunakan swab dari canalis servicalis babi yang menderita endometritis yang dilihat dari gejala yang
tampak dan pemeriksaan USG
Isolasi sampel pada media MacConcey Agar dan Blood Agar
SKRIPSI UJI KEPEKAAN BEBERAPA CAHYANI KARTIKA MAHARANI