BERDASARKAN ANALISIS SEKUEN KOMPLIT DAERAH D-LOOP MITOKONDRIA (mtDNA D-LOOP)
MATERI DAN METODE
Sampel Ayam dan Materi Genom DNA
Sampel ayam yang digunakan dalam penelitian meliputi 6 ayam asli Indonesia yang langka (BkSr, Bkk, BRG, GUN, SUM dari populasi Indonesia dan Amerika Utara dan WLK), 17 ayam Indonesia yang lain: arab golden red ARGj dan ARGb, arab silver ARGs, bangkok BgK, black java (BJ dari Amerika Utara), cemani (CMN), gaga’ (GAG), kampung (KPGb, KPGb, KPGg, KPGbd, KPGs dan KPGsl), kate KT, kapas KPS, kedu hitam (KDh), kedu lurik (KDl), kedu putih (KDp), kukuak balenggek (AKB), pelung (PLg), nunukan (NNK), sentul (STL), dan serama SRM), dan ayam ras komersial (BRO dan L) dari berbagai wilayah di Indonesia (Tabel 2, Gambar 1 dan 3-10).
Amplifikasi Daerah mtDNA D-loop and Sekuening
Sekuen mtDNA D-loop sepanjang 1440 base pair (bp) diamplifikasi dengan menggunakan 2 pasang primer seperti yang ditampilkan pada Tabel 3. Sekuen referensi dari mtDNA D-loop ayam NC_007237 (Nishibori et al. 2005) digunakan sebagai sekuen referensi pada penelitian ini. Panjang sekuen yang teramplifikasi adalah 1440 bp yang mencakup sekuen komplit mtDNA D-Loop ayam (1227 bp) seperti yang direkomendasikan oleh (Desjardins dan Morais 1990).
Tabel 3 Sekuen primer untuk amplifikasi daerah D-loop mtDNA ayam lokal Indonesia (Desjardins dan Morais 1990).
No Forward (5’ –3’)/ Reverse (5’ –3’) Panjang Sekuen (bp)
1 GGTTAGACCCCAAGGACTAC/ ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG 630
2 CCTCACGAGAGATCAGCAAAC/ GGCACTGAAGATGCCAAGATG 854
Fragmen mtDNA D-loop diamplifikasi dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi pasangan primer 1 dilakukan dengan menggunakan komponen PCR mix yang terdiri dari DreamTaqTM Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP dan dTTP masing-masing 0,4 mM dan 4mM MgCl2, 100-200 ng DNA genom, dan air distilata. Kondisi PCR yang digunakan meliputi pre denaturasi pada suhu 95°C (3 menit) diikuti dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95°C (30 detik), penempelan pada suhu 60°C (30 detik), pemanjangan pada suhu 72°C (40 detik) dan pemanjangan akhir pada suhu 72°C (5 menit).
Amplifikasi pasangan primer 2 dilakukan dengan menggunakan komponen PCR mix yang terdiri dari High-fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific Phusion Flash), 100-200 ng DNA genom dan air distilata. Kondisi PCR meliputi predenaturasi pada suhu 98oC (10 detik) dan kemudian dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98oC selama 1 detik, penempelen dan pemanjangan pada suhu 68oC selama 20 detik yang diulang 35 siklus. Setelah itu dilakukan pemanjangan akhir pada suhu 72oC (1 menit). Visualisasi produk PCR dielektroforesis dengan menggunakan gel polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dalam TBE1x pada 200V selama 30 menit. Hasil elektroforesis diwarnai dengan metode pewarnaan perak berdasarkan Byun et al. (2009) yang dimodifikasi. Produk PCR selanjutnya disekuensing pada kedua arah (forward dan reverse) dengan menggunakan BigDye Terminator Kit pada ABI 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) menggunakan pasangan primer yang sama yang digunakan untuk amplifikasi.
Analisis Data
Penelitian ini menggunakan sekuening ganda (forward dan reverse) pada masing-masing pasangan primer sehingga diperoleh panjang sekuen mtDNA D- loop sepanjang 1227 bp. Insersi dan delesi (indels) basa nukleotida yang ditemukan pada sekuen mtDNA D-Loop ayam tidak dipertimbangkan dalam analisis data selanjutnya. Perunutan sekuen mtDNA D-Loop ayam dilakukan dengan menggunakan program MUSCLE (Edgar 2004) pada program Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) versi 6 (Tamura et al. 2013). Keragaman haplotype (Hd), keragaman nukleotida (π) dan diferensiasi genetik (FST) diduga dengan menggunakan program DnaSP versi 5.10.01. (Librado dan Rozas 2009).
Penelitian ini menggunakan 3 jenis data. Data pertama meliputi 679 sekuen komplit D-loop (1227 bp) dari 524 ayam lokal Indonesia, ayam ornamental, ayam ras komersial dan ayam hutan (Tabel 1), 29 ayam dari Laos (Kawabe et al. 2014), 9 ayam pesuara dari Jepang (Komiyama et al. 2004a), 20 ayam dari Korea (Cho et al. 2010), 18 ayam dari Bangladesh (Islam dan Nishibori 2012), 8 ayam dari Bhutan (Nidup et al. 2005, 10 ayam dari Afrika (Mwacahro et al. 2011) dan 61 sekuen D-
25
loop ayam yang merupakan haplotype utama dari 12 haplogroup (A-I dan W-Y) dari 2874 individual ayam domestik dan ayam hutan di seluruh dunia seperti yang dijelaskan oleh Mioa et al. (2013) sebagai koreksi terhadap klasifikasi haplogroup sebelumnya (A-I) menurut Liu et al. (2006b) (Lampiran 3). Analisis unrooted neighbor-joining (NJ) dari semua sekuen D-loop ayam dilakukan dengan menggunakan program MEGA versi 6 (Tamura et al. 2013) untuk mendapatkan gambaran sederhana tentang haplogroup ayam asli Indonesia dan hubungannya dengan ayam lokal Indonesia dan ayam-ayam dari negara-negara lain. Seratus sembilan puluh delapan (198) sekuen mtDNA D-loop ayam Indonesia yang merupakan perwakilan dari setiap haplogroup disimpan pada Genbank NCBI dengan no aksesi KR535995-KR536177 dan KT853000-KT853016 (Lampiran 3). Data kedua mencakup 524 sekuen mtDNA D-loop (1227 bp) ayam lokal Indonesia yang langka dan ayam lokal Indonesia yang lain dan ayam hutan (AHMj, AHMs dan AHH) (Tabel 2) untuk memperkirakan hubungan genetik antara ayam langka Indonesia dengan ayam asli dan ayam lokal Indonesia lainnya dan dengan ayam hutan. Lokus segregasi, keragaman haplotype (H) dan keragaman genetik (π) dari sekuen D-loop ayam lokal Indonesia dihitung dengan menggunakan program DNA Sequence Polymorphism (DnaSP) versi 5.10.01 (Librado dan Rozas 2009). Pohon filogeni untuk menduga hubungan genetik antara ayam lokal Indonesia yang langka dengan ayam lokal Indonesia lainnya dan ayam hutan dibentuk berdasarkan analisis Bayesian dengan menggunakan program Mr. Bayes versi 3.0 (Ronquist dan Huelsenbeek 2003) dengan mempertimbangkan model umum (general time reversible model): rates=invgamma dan nst=6). Markov Chain Monte Carlo (MCMC) dioperasikan masing-masing untuk 1 juta generasi. Pohon filogeni selanjutnya dibentuk untuk setiap 500 siklus dari iteration chain. Penelitian ini menggunakan standar deviasi (SD)=0.012589 yang dihitung setelah dilakukan analisis 1 juta generasi. Titik (node) dengan nilai probabilitas posterior ≥ 95% digunakan untuk membentuk konsensus pohon filogeni 50%. Pohon filogeni
selanjutnya divisualisasikan dengan program FigTree v1.4.0
(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/.).
Data ketiga disusun untuk menganalisis profil hubungan haplogroup utama yang ditemukan pada ayam asli Indonesia yang langka dan ayam asli Indonesia yang lainnya (haplogroup B, C, D, E dan Y) dengan menggunakan analisis median joining network (MJ). Data ketiga ini mencakup 616 sekuen mtDNA D-loop dari 490 ayam Indonesia dan 29 ayam dari Laos (Kawabe et al. 2014), 9 ayam pesuara dari Jepang (Komiyama et al. 2004a), 20 ayam dari Korea (Cho et al. 2010), 18 ayam dari Bangladesh (Islam dan Nishibori 2012), 8 ayam dari Bhutan (Nidup et al. 2005, 10 ayam dari Afrika (Mwacahro et al. 2011), 32 ayam dari Saudi Arabia (Yacoub dan Fathi 2013) dan 42 ayam yang mempunyai haplotype utama dari 5 haplogroup ayam di dunia yang ditemukan pada ayam lokal Indonesia (B, C, D, E dan Y) (Miao et al. 2013). Analisis MJ dilakukan dengan mengikuti algoritma Bandelt et al. (1999) dan program NETWORK software versi 5.0.0.0 (http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm. DNA Alignment Software versi 1.3.3.2. (www.fluxus-engineering.com/dnaalignterms11.htm) digunakan sebelum melakukan analisis MJ. Visualisasi hubungan antar haplotype ayam diilustrasikan dengan menggunakan program Network Publisher 2.0.0.1 (www.fluxus- engineering.com/nwpubterms.htm).
Analisis MJ pada penelitian ini digunakan untuk membuat hubungan berdasarkan haplotype utama dari 12 haplogroup (A-I and W-Y) yang direkomendasikan oleh Miao et al. (2013) sebagai koreksi dari penentuan haplotype sebelumnya menurut Liu et al. (2006b). Hubungan antar haplogroup juga digunakan untuk memahami aliran genetik, wilayah penyebaran, asal-usul dan memperkirakan pusat domestikasi ayam. Tatanama haplogroup yang digunakan oleh Miao et al. (2013) selanjutnya digunakan sebagai referensi pemberian nama haplogroup dalam penelitian ini. Sekuen komplit mtDNA D-loop (1227 bp) AHH dari Madura (AHHm702) digunakan sebagai outgroup dalam analisis MJ. Pengelompokan wilayah penyebaran ayam dilakukan berdasarkan kriteria yang ditetapkan dalam State of the World’s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture; SoW-AnGR), (FAO 2007) yang menetapkan 7 wilayah regional SOW- AnGR, yaitu Afrika, Asia (termasuk India), Eropa, Kaukasus, Amerika Latin, Karibia, Mediterania dan sekitarnya, Amerika Utara dan Baratdaya Pasifik, sehingga breed ayam juga dapat dikategorikan sebagai (1). Breed asli dan (2). Breed lintas batas (Tabel 4).
Tabel 4 Kategori breed ayam berdasarkan wilayah regional penyebaran berdasarkan State of the World’s Animal Genetic Resources for Food and Agriculture (SoW-AnGR) (FAO 2007)
No Breed Definisi
1 Breed asli Breed yang hanya ada di 1 negara 2 Breed lintas batas Breed yang ada di lebih dari 1 negara
a. Breed lintas regional Breed lintas batas yang hanya ada di salah satu di antara 7 wilaya regional SoW- AnGR
a. Breed lintas internasional
Breed yang ada di lebih dari 1 wilayah regional SoW-AnGR