Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus sampai dengan November 2009. Semua kegiatan dikonsentrasikan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah dan Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Alat
Alat yang digunakan pada penelitian adalah sentrifuge, cawan Conway,
penangas air, gelas piala, eksikator, botol selai, label, magnetic stirrer, botol film, tabung destilasi, tabung gas CO2, oven dengan suhu 1050C, oven 600C, tabung fermentor, gelas ukur, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, tutup karet, isolasi panfiks,
plastik tahan panas, spoit, buret, pipet mikro, pipet volumetrik, bulp, pH meter,
sprayer, timbangan digital, autoclave, shaker bath, vortex, spektrofotometer UV 200 RS, sarung tangan dan alumunium foil.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian antara lain: cairan rumen, jerami padi, rumput gajah, aquades, medium BHI (brain heart infusion), glukosa, celubiosa, cystein-HCl, resazurin, hemin, aquadest, larutan McDougall, asam borat, larutan HgCl2, larutan Na2CO3 jenuh, larutan H2SO4, susu steril, calf starter, 12 isolat bakteri, vaselin, gas CO2, dan 4 jenis sumber mineral (CoCl2.6H2O, CuSO4. 5H2O, ZnSO4. 7H2O, MnSO4. H2O).
Rancangan Percobaan Rancangan Percobaan
Percobaan 1 dalam penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 3 ulangan, sedangkan percobaan 2 dan 3 menggunakan 2 ulangan. Model matematik yang digunakan dalam analisa statistik adalah:
16 Keterangan: Yij = Nilai pengamatan pada ulangan ke-j dan perlakuan ke-i, µ = Nilai rataan umum, τi = Pengaruh perlakuan ke-i, εij = Error perlakuan ke-i dan ulangan ke-j.
Data yang diperoleh dianalisis ragam (Analysis of Variance, ANOVA) berdasarkan Steel dan Torrie (1993). Selanjutnya, jika perlakuan berbeda nyata maka dilakukan uji kontras ortogonal.
Prosedur
Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap percobaan. Tahap pertama dilakukan pemilihan isolat bakteri dari 12 isolat bakteri menjadi 6 isolat bakteri berdasarkan produksi bahan kering (BK) sel isolat bakteri, nilai CMC-ase, dan jumlah bakteri yang dihasilkan pada penelitian sebelumnya (Astuti, 2010). Tahap kedua dilakukan kajian pertumbuhan 6 isolat bakteri terpilih di dalam media calf starter yang disuplementasi mineral (Co, Cu, Zn, dan Mn) berkonsentrasi tinggi dengan peubah yang diukur adalah produksi bahan kering (BK) sel isolat bakteri, nilai pH, dan jumlah bakteri. Penelitian tahap ketiga dilakukan untuk menguji fermentabilitas in vitro menggunakan konsorsium 6 isolat bakteri terpilih dalam media terbaik hasil pengujian tahap kedua.
Persiapan Sampel
Pembuatan larutan mineral Co, Cu, Zn, atau Mn dilakukan pertama kali sebelum pembuatan media BHI. Konsentrasi mineral dalam media diperhitungkan agar mencapai 75% dari batas toksik (Georgievskii et al., 1982) untuk pertumbuhan bakteri rumen. Perhitungan dan penimbangan dilakukan dengan mempetimbangkan jenis sumber mineral, memperhitungkan bobot molekul dan bobot atom masing-masing mineral. Senyawa sumber mineral tersebut dilarutkan dalam 1 liter aquades untuk dijadikan larutan stok mineral.
Metode
Percobaan Tahap 1: Kajian Adatasi Bakteri Terhadap Suplementasi Mineral
Penelitian ini bertujuan menseleksi 12 isolat bakteri rumen koleksi Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan IPB. Setiap isolat bakteri ditumbuhkan dengan menyuntikannya
17 ke dalam tabung reaksi yang berisi media BHI yang telah tercampur dengan salah satu mineral (Co, Cu, Zn, atau Mn). Setiap kombinasi perlakuan isolat dengan jenis mineral dilakukan dalam 3 ulangan. Isi tabung yang mengandung BHI tersebut telah dikondisikan anaerob. Isolat bakteri dalam tabung diinkubasikan selama 3 hari. Pada akhir inkubasi jumlah produksi bahan kering (BK) sel dan jumlah bakteri dari semua isolat yang telah ditumbuhkan di dalam media BHI diukur.
Data produksi bahan kering sel bakteri digunakan untuk mengetahui daya adaptasi isolat bakteri terhadap kadar beberapa mineral di dalam media BHI. Berdasarkan data tersebut dan data CMC-ase dari penelitian sebelumnya (Astuti, 2010) dipilih sebanyak 6 isolat bakteri untuk ditumbuhkan dalam media calf starter
(kajian kedua).
Pembuatan Media BHI Bermineral Tinggi
Media BHI yang digunakan dalam kajian tahap ini mengandung Co, Cu, Zn dan Mn tinggi. Bahan yang digunakan dalam pembuatan media BHI adalah BHI 7,4 g; cystein HCl 0,1 g; pati 0,1 g; glukosa 0,1 g; selebiosa 0,1 g; resazurin 1 ml; dan hemin 0,6 ml. Semua bahan dilarutkan menjadi 200 ml menggunakan aquades yang telah mengandung Co 18,33 ppm atau 75% dari kadar toksik Co. Sebanyak 200 ml larutan BHI dibuat dengan prosedur yang sama untuk mendapatkan larutan yang mengandung Cu 5,39 ppm atau 75% dari kadar toksik Cu, begitu pula dengan mineral Zn dan Mn yaitu dengan konsentrasi masing-masing 18,38 ppm dan 1176,5 ppm. Pelarutan komponen penyusun BHI dilakukan dengan pemanasan. Setiap larutan kemudian dialiri dengan gas CO2 selama 20 menit dan larutan dipipet 5 ml untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Jumlah tabung reaksi yang digunakan adalah 36 buah untuk setiap perlakuan mineral. Seluruh tabung reaksi ditutup menggunakan sumbat karet dan disterilisasi dengan menggunakan autoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati pada penelitian ini yaitu: produksi bahan kering (BK) sel isolat bakteri (mg/ml), pH media, dan jumlah bakteri (cfu/ml).
18
Percobaan Tahap 2: Adaptasi Isolat Bakteri Terpilih dalam Media Calf Starter
Percobaan tahap kedua dilakukan dengan menumbuhkan 6 isolat bakteri terpilih di dalam media calf starter. Setiap isolat bakteri dari enam isolat terpilih disuntikan ke dalam tabung reaksi yang yang telah berisi calf starter yang telah tercampur dengan salah satu mineral (Co, Cu, Zn, atau Mn). Setiap kombinasi jenis isolat bakteri dan mineral dilakukan dalam 2 ulangan. Media yang telah diinokulasi isolat bakteri tersebut diinkubasi selama 3 hari kemudian. Peubah yang diukur adalah nilai pH media, produksi BK sel isolat bakteri, dan jumlah bakteri.
Pembuatan Media Calf Starter
Calf starter ditimbang sebesar 0,05 g dan dimasukan ke dalam tabung rekasi. Bahan pakan dalam tabung reaksi tersebut ditambah larutan McDougall sebanyak 5 ml dan larutan mineral Co, Cu, Zn, atau Mn sehingga konsentrasi masing-masing mineral mencapai 3,74 ppm (Co); 1,09 ppm (Cu); 3,68 ppm (Zn); atau 235,3 ppm (Mn). Jumlah tabung reaksi yang berisi calf starter yang disuplementasi mineral Co, Cu, Zn, atau Mn yang digunakan untuk setiap isolat masing-masing 12 tabung. Sebelum isolat dimasukan ke dalam tabung, tabung reaksi bersama media di dalamnya disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 1210C selama 20 menit.
Inokulasi Isolat Bakteri ke dalam Media Calf Starter Bermineral
Biakan bakteri yang dihasilkan dari penelitian sebelumnya atau penelitian tahap 1, diambil sebanyak 0,1 ml dari stok bakteri dengan menggunakan spoit, lalu bakteri tersebut disuntikan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang berisi media
calf starter bermineral tinggi. Jumlah dan teknik memasukan isolat bakteri ke dalam tabung reaksi yang berisi media calf starter, sama seperti yang dilakukan pada media BHI. Setelah itu, media yang sudah mengandung calf starter bermineral tinggi diinokulasi isolat bakteri diinkubasi selama 3 hari dalam shaker water bath pada suhu 390C.
Peubah yang Diamati
Peubah yang diamati pada penelitian ini yaitu: pH media, produksi bahan kering (BK) sel isolat bakteri (mg/ml), dan jumlah bakteri (cfu/ml). Pengukuran pH media dilakukan sebagai berikut: media yang sudah diinkubasi selama 3 hari
19 diangkat dari shaker water bath untuk diukur nilai pHnya. Masing-masing tabung reaksi diambil sebesar 1 ml larutan untuk diukur besarnya pH dengan menggunakan alat pH meter. Pengukuran BK sel bakteri adalah sebagai berikut: bahan kering sel bakteri diukur dengan cara media yang sudah tercampur bakteri diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung eppendorf untuk disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 7000 rpm. Setelah itu, supernatan dibuang dan endapan bersama wadahnya dimasukkan ke dalam oven 600C selama 1 hari, kemudian dimasukkan ke dalam oven 1050C. Perhitungan populasi bakteri dilakukan dengan mengamati pertumbuhan bakteri dengan mengukur optical density (OD) media menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
Percobaan Tahap 3: Kajian Fermentabilitas Jerami Padi dan Rumput Gajah in vitro menggunakan Konsorsium Enam Isolat Bakteri Terpilih.
Perlakuan dalam percobaan 3 ini terdiri atas 4 perlakuan dengan 2 ulangan dimana pada percobaan dengan penambahan mineral organik diberikan penambahan 6 isolat bakteri yang terpilih pada percobaan 2. Adapun perlakuan tersebut adalah sebagai berikut: (1) Media Rumput Gajah dengan perlakuan sebagai berikut: RG+OR = Rumput Gajah + Mineral Organik; RG+SU = Rumput Gajah + Susu; RG = Rumput Gajah; RG+MIX = Rumput Gajah + Premix. Mineral organik mengandung Co (0,00098 ppm), Cu (0,097 ppm), Zn (0,396 ppm), Mn (0,393 ppm), Cr (10 ppm), susu dan bakteri. (2) Media Jerami Padi dengan perlakuan sebagai berikut: JP+OR = Jerami Padi + Mineral Organik; JP+SU = Jerami Padi+ Susu; JP = Jerami Padi;
JP+MIX = Jerami Padi + Premix. Mineral organik mengandung Co (0,00098
ppm), Cu (0,097 ppm), Zn (0,396 ppm), Mn (0,393 ppm), Cr (10 ppm), susu dan bakteri.
Pembuatan Mineral Organik dengan Media Susu
Empat buah botol 250 ml diisi susu masing-masing sebanyak 200 ml. Kemudian ke dalam susu ditambahkan 2 ml larutan mineral Co, Cu, Zn, atau Mn sehingga masing-masing media susu mengandung 3,74 ppm (Co); 1,09 ppm (Cu); 3,68 ppm (Zn), atau 235,3 ppm (Mn). Media susu bermineral dalam botol disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 1210C selama 20 menit. Botol berisi
20 media susu bermineral tersebut diinokulasi dengan campuran 6 isolat bakteri yang selanjutnya diinkubasi selama 3 hari.
Isolat Bakteri yang Digunakan
Isolat bakteri yang digunakan pada tahap ini ialah campuran keenam isolat bakteri (B, C, E, F, G, dan L) yang ditumbuhkan dalam media susu. Hal tersebut disebabkan oleh kemampuan hidup isolat bakteri dalam media susu lebih baik dibandingkan dengan media yang lain.
Pengukuran NH3
Konsentrasi NH3 diukur dengan menggunakan teknik Mikrodifusi Conway (Conway, 1958). Bibir cawan Conway dan tutupnya diolesi dengan vaselin, kemudian supernatan yang dihasilkan dari pencernaan fermentatif diambil sebanyak 1 ml dan ditempatkan pada salah satu ruang sekat cawan dan larutan Na2CO3 jenuh ditempatkan pada ruang sekat yang lain. Larutan asam borat sebanyak 1 ml berindikator ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway. Selanjutnya cawan Conway ditutup rapat agar udara tidak dapat masuk. Supernatan dan larutan Na2CO3 jenuh dicampur hingga merata dengan cara menggoyang-goyangkan cawan dan memiringkannya. Setelah itu, cawan dibiarkan selama 24 jam pada suhu kamar, dan setelah 24 jam cawan dibuka. Pada bagian asam borat selanjutnya dititrasi dengan larutan H2SO4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna biru ke warna asam borat (merah jambu). Konsentrasi NH3 dihitung dengan rumus :
N NH3 (mM) = ml H2SO4 x N H2SO4 x 1000 g sampel x BK sampel
Pengukuran Volatile Fatty Acid (VFA)
Konsentrasi VFA diukur dengan menggunakan teknik destilasi uap (Steam destilation) (General Laboratory Procedure, 1966). Lima mililiter supernatan (berasal dari tabung yang sama dengan supernatan untuk analisa NH3) dimasukkan ke dalam tabung destilasi, lalu ditambahkan 1 ml H2SO4 15%. Dinding tabung dibilas dengan aquadest dan secepatnya ditutup dengan sumbat karet yang telah dihubungkan dengan pipa destilasi berdiameter ±0,5 cm. Kemudian ujung pipa yang lain dihubungkan dengan alat pendingin Leibig. Tabung destilasi dimasukkan ke dalam
21 labu didih yang telah berisi air mendidih tanpa menyentuh permukaan air tersebut. Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Hasil destilasi ditampung dengan labu Erlenmeyer 500 ml yang telah diisi 5 ml NaOH 0,5 N. Proses destilasi selesai pada saat jumlah destilat yang tertampung mencapai 300 ml. Destilat yang tertampung ditambah indikator phenolphtalein (PP) sebanyak 2-3 tetes, lalu dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai terjadi perubahan dari warna merah jambu menjadi tidak berwarna (bening). Perhitungan Produksi VFA total adalah sebagai berikut:
VFA total = (volume titran blanko-volume titran sampel) x N HCl x 1000/5 mM g sampel x BK sampel
22