BAB II TINJAUAN PUSTAKA
BAB 3 MATERI DAN METODE PENELITIAN 3.1Tempat dan Waktu Penelitian 3.1Tempat dan Waktu Penelitian
Tempat penelitian dilaksanakan di Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. Pembuatan ekstrak Spirulina platensis dilakukan di Laboratorium Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga. Proses pembuatan hapusan darah, penghitungan jumlah leukosit di Laboratorium Patologi Klinik Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.
3.2Waktu Penelitian
Waktu Penelitian berlangsung selama satu bulan Bulan April sampai Bulan Mei 2016
3.3Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium. Pada penelitian ini variable yang diamati adalah jumlah leukosit ikan gurame. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena kondisi lingkungan dan berat badan yang bersifat homogen, serta sampel dilakukan secara acak dengan empat macam kelompok perlakuan.
3.4Materi Penelitian 3.4.1 Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan gurame (Oshpronemus gouramy) sebanyak 20 ekor dengan berat badan rata-rata 20 gram
21
dan panjang tubuh 9-10 cm dari kolam yang sama. Hewan coba diperoleh dari Kolam Minazas, Desa bakung, Kecamatan Udan Awu, Blitar.
3.4.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang diperlukan antara lain pakan ikan standar berbentuk pellet (Takari®_PT. Central Proteinaprima., Tbk, kode produksi PCP401), air Sumur, Ekstrak Spirulina platensis, bakteri Aeromonas hydrophila yang berjumlah 106 CFU/ml didapat dari Balai Karantina Perikanan Surabaya, dengan pengenceran 100 ml. Bahan untuk pembuatan ekstrak Spirulina platensis adalah tepung Spirulina platensis yang di dapat dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau Jepara.
Bahan-bahan untuk pengambilan darah, pembuatan hapusan darah, dan penghitungan jumlah leukosit pada ikan gurame adalah Heparin, larutan Dacies, methanol 95%, zat warna Giemsa beserta Larutan Buffer Pro Giemsa, dan minyak emersi.
3.4.3 Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini adalah akuarium (ukuran volume 5 L) sebanyak 5 buah, mesin aerator, selang aerator, filter pembersih air, batu zeloit, timbangan milligram digital, dan jaring ikan kecil. Peralatan untuk Pengambilan darah diperlukan spuit insulin 1 ml dengan jarumnya, tabung ependorf. pembuatan hapusan darah diperlukan glas obyek, dan rak tempat pemulas glas obyek. Penghitungan jumlah leukosit dan hitung jenis leukosit pada ikan gurame diperlukan kamar hitung Improved Neubauer, Pipet Pasteur,, counter, gelas penutup, mikroskop, gelas obyek, rak tempat pemulas gelas obyek.
3.5.1 Penentuan Dosis Spirulina platensis
Penentuan dosis berdasarkan penelitian pendahuluan yang telah dilakukan yaitu dengan bentuk ekstrak air panas Spirulina plantensis. Dosis penelitian tersebut adalah 200 mg/L, 400 mgL, 600 mg/L. Tayag et al., (2010) Perhitungan dosis Spirulina platensis di uraikan pada Lampiran 1.
3.5.2 Penentuan Jumlah Sampel
Rumus besaran sampel adalah t(n-1)> 15, dimana t adalah banyaknya perlakuan dan n adalah banyaknya ulangan (Kusriningrum, 2010). Dalam penelitian ini digunakan 5 perlakuan. Dari rumus tersebut maka ulangan terkecil yang digunakan adalah 4 ekor ikan dalam setiap perlakuan. Untuk menghindari bias maka ditambah 1 ekor pada setiap kelompok perlakuan, sehingga seluruh ulangan tiap perlakuan 5 ekor ikan gurame.
3.5.3 Perlakuan Penelitian
Setelah adaptasi selama satu minggu, semua kelompok perlakuan dari hewan coba di Dipping ekstrak spirulina dengan dosis disetiap perlakuan dan diinfeksi bakteri Aeromonas hydrophila, kecuali PO(-)
P0- : Kelompok perlakuan kontrol negatif
Ikan tanpadirendam ektrak Spirulina platensis dan tanpa diinfeksi bakteri Aeromonas hydrophila.
P0+ : Kelompok perlakuan kontrol positif
Ikan tanpa direndam ektrak Spirulina platensis, selanjutnya diinfeksi Aeromonas hydrophila 106 sel/ml pada hari ke-15
23
P1 : Ikan direndam ekstrak air Spirulina platensis konsentrasi 200 mg/L secara dipping selama 3 jam pada hari pertama dan pada hari ke tujuh, selanjutnya diinfeksi Aeromonas hydrophila 106 sel/ml pada hari ke-15
P2 : Ikan direndam ekstrak air Spirulina platensis konsentrasi 400 mg/L secara dipping selama 3 jam pada hari pertama dan pada hari ke tujuh, selanjutnya diinfeksi Aeromonas hydrophila 106 sel/ml pada hari ke-15
P3 : Ikan direndam ekstrak air Spirulina platensis konsentrasi 600 mg/L secara dipping selama 3 jam pada hari hari pertama dan pada hari ke tujuh, selanjutnya diinfeksi Aeromonas hydrophila
106 sel/ml pada hari ke-15
Pada hari ke-3 setelah perlakuan, darah ikan diambil sesuai proses kemudian diamati gambaran jumlah leukosit dan hitung jenis leukosit.
3.6Pengambilan Darah untuk Pemeriksaan Jumlah Leukosit dan Hitung Jumlah Sel Leukosit
3.6.1 Punksi Pembuluh Darah Bagian Caudal
Setelah perlakuan selesai, ikan dikorbankan untuk memulai pengambilan darah dengan teknik Punksi Pembuluh Darah Bagian Caudal. Teknik ini biasa dipergunakan untuk pengambilan sampel darah ikan berukuran besar (>10 cm). Teknik ini mempunyai kelebihan yaitu bisa dipergunakan berulang pada satu ikan. Pengambil darah ikan dengan menggunakan teknik ini yaitu dengan menyiapkan spuit insulin lengkap dengan jarumnya dan kemudian dihisap larutan heparin sampai memenuhi didinding syringe dan hanya disisakan sebanyak ± 50 µl di
dalam spuit. Pengambilan darah ikan dengan memposisikan jarum pada garis tengah tubuh belakang sirip anal kemudian memasukkan jarum kedalam musculus sampai mencapai tulang belakang (columna spinalis) dengan memastikan tidak terdapat gelembung air yang masuk dalam spuit. Kemudian ditarik perlahan-lahan sampai darah masuk ke dalam spuit (Bijanti, 2010).
3.6.2 Pemeriksaan Jumlah Leukosit dan Hitung Jenis Sel Leukosit 3.6.2.1 Pemeriksaan Jumlah Sel Leukosit
Menurut Bijanti (2010), metode pemeriksaan jumlah leukosit yaitu sampel darah diencerkan dengan perbandingan 1:50 menggunakan larutan Dacies yang telah disaring. Pencampuran darah dengan larutan Dacies secara perlahan agar tidak merusak sel darah. Ambil sedikit campuran darah dan larutan Dacies dengan menggunakan pipet Pasteur, kemudian teteskan dalam kamar hitung Improved Neubauer. Letakkan cover glass di atas kamar hitung Improved Neubauer. Kemudian hitung jumlah leukosit yang terdapat pada semua kotak leukosit dengan menggunakan mikroskop.
3.6.2.2 Menghitung Jumlah Sel Leukosit
Perhitungan jumlah sel leukosit menggunakan mikroskop dengan pembesaran 10x dengan menurunkan lensa kondensor. Kamar hitung dengan bidang bergarisnya diletakkan di bawah obyektif dan fokus mikroskop diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Kemudian dihitung semua leukosit yang terletak pada ke empat bidang besar (kotak yang berwarna hijau) pada lampiran 4. Perhitungan dimulai dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke bawah dan dari kanan kekiri (pada empat kotak berwarna hijau). Sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau garis atas haruslah dihitung, sebaliknya sel-sel yang
25
menyinggung garis batas sebelah kanan atau garis bawah tidak boleh dihitung (Bijanti, 2010).
3.6.2.3 Pemeriksaan Hitung Jenis Sel Leukosit
Menurut Bijanti (2010), metode pemeriksaan jumlah leukosit yaitu satu tetes sampel darah diletakkan pada slide yang kering dan bersih kemudian buat hapusan darah yang tipis. Keringkan hapusan darah, kemudian hapusan darah yang telah difiksasi dengan metanol 95% selama 1-2 menit, menggunakan pengecatan Giemsa atau May Grunwald ditunggu selama ± 5 menit. Kemudian bilas slide dengan menggunakan air mengalir dan keringkan. Periksa hapusan darah di bawah mikroskop menggunakan emersi (obyektif 1000x) (Bijanti, 2010).
Perhitungan dilakukan pada daerah penghitung (Counting Area) dengan memilih bagian dari sediaan yang cukup tipis dengan penyebaran leukosit merata. Perhitungan dimulai dari bagian pinggir atas sediaan kemudian berpindah ke arah pinggir bawah dengan menggunakan mikro manipulator mikroskop. Pada daerah bawah pinggir mulai digeser ke lapangan bagian kanan lebih banyak dari lebarnya emersi, kemudian ke arah pinggir atas lagi. Pada bagian atas geser ke kanan lagi dan kemudian diarahkan ke bagian bawah. Perhitungan ini dilakukan terus-menerus sampai 100 sel (Bijanti dkk., 2014).
3.7Variabel Penelitian
Beberapa peubah yang diamati dalam penelitian ini meliputi:
Variabel bebas : Dosis ekstrak Spirulina platensis 200 mg/L, 400 mg/L, 600 mg/L dan Bakteri Aeromonas
Variabel tergantung : Jumlah Leukosit dan hitung jenis Leukosit ikan
Gurame
Variabel kendali : ikan gurame, berat badan ikan, kolam, jumlah
pakan.
3.8Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Data yang akan diperoleh dalam bentuk nilai jumlah leukosit dan jumlah jenis leukosit hewan coba disusun dalam bentuk tabel yang kemudian akan dianalisis. Untuk mengetahui perbedaan gambaran jumlah dan hitung jenis sel leukosit akibat pemberian bakteri Aeromonas hydrophila yang telah diinfeksi dengan dosis yang berbeda, dan akan dilakukan uji statistik dengan menggunakan sidik ragam ANOVA (Analysis of Variant). Apabila terdapat adanya perbedaan antar perlakuan dilanjutkan dengan uji Jarak Berganda Duncan dengan taraf signifikansi sebesar 5% untuk mengetahui perlakuan yang terbaik. Analisis data dilakukan dengan menggunakan peralatan lunak komputer SPSS 18 for Windows.
27
3.9 Diagram Alur Penelitian
20 Ikan Gurame Ikan diadaptasikan selama 1 minggu
P0 (-) : tanpa diberi ekstrak Spirulina P3 : perendaman pertama ekstrak Spirulina 600 mg/L selama 3 jam P2 : perendaman pertama ekstrak Spirulina 400 mg/L selama 3 jam P1 : perendaman pertama ekstrak Spirulina 200 mg/L selama 3 jam P0 (+) : tanpa diberi ekstrak Spirulina
Infeksi Aeromonas hydrophila
24 jam setelah perendaman kedua ekstrak Spirulina Dipindahkan kembali ke akuarium pemeliharaan P0 (-) : tanpa diberi ekstrak Spirulina P3 : perendaman kedua ekstrak Spirulina 600 mg/L selama 3 jam P2 : perendaman kedua Spirulina 400 mg/L selama 3 jam P1 : perendaman kedua ekstrak Spirulina 200 mg/L selama 3 jam P0 (+) : tanpa diberi ekstrak Spirulina
3 hari setelah infeksi
Analisis data Pengambilan sampel darah, pemeriksaan jumlah leukosit, dan
pemeriksaan hitung jenis leukosit