3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilaksanakan pada bulan Februari – Maret 2015 pada empat lokasi yaitu di Laboratorium Hewan Coba, Departemen Kedokteran Dasar Fakultas Kedokteran Hewan, pembuatan preparat histopatologi hepar tikus putih (Rattus norvegicus) di Gedung Diagnostic Center RSUD Dr.Soetomo Surabaya, serta pengamatan dan skoring preparat histopatologi di Departemen Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
3.2 Rancangan Penelitian
Rancangan percobaan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Hal tersebut dikarenakan semua kondisi lingkungan dan umur tikus putih dibuat homogen dan perlakuan sampel dilakukan secara acak. Dalam rancangan percobaan yang digunakan hanya terdapat satu sumber keragaman yakni pengaruh perlakuan, sehingga hasil perbedaan antar perlakuan hanya disebabkan pengaruh perlakuan (Kusriningrum, 2008).
3.3 Variabel penelitian
Adapun klasifikasi variabel penelitian ini adalah sebagai berikut : Variabel bebas : berbagai konsentrasi ekstrak bawang merah. Variabel tergantung : gambaran histopatologi hepar.
Variabel terkendali :umur, berat badan, pakan, jenis kelamin tikus putih (Rattus norvegicus), waktu pemberian ekstrak
bawang merah.
3.4 Materi Penelitian 3.4.1 Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak bawang merah (Allium Ascallonicum), aloksan, metformin, CMC Na 0,5%, pakan ayam, aquadest, air minum, sekam untuk alas kandang, alkohol 70%.
3.4.2 Instrumen penelitian
Instumen yang digunakan pada penelitian ini adalah lima buah kandang plastik polipropilen berukuran 40 cm x 60 cm dengan tutup anyaman kawat, alat penimbang berat badan, tempat pakan, botol air minum, alat pengukur glukosa darah merk EasyTouch, strip glucometer, alat suntik, sonde lambung, sarung tangan, kapas, toples, kertas label, alat tulis, dan alat dokumentasi. Pembuatan ekstrak bawang merah diperlukan gelas ukur, baskom plastik, timbangan, blender, saringan, spatula, corong Buchner, pompa hisap, rotavapour, labu pisah, kertas saring, dan lemari pendingin. Pemeriksaan histopatologi diperlukan optilab, dan mikroskop.
3.4.3 Populasi dan sampel
Hewan coba yang digunakan pada penelitian ini yaitu 20 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur wistar berumur tiga bulan dengan berat badan 150-200 gram, memiliki aktivitas normal dan tidak tampak kelainan tubuh.
Tikus putih diadaptasikan terlebih dahulu selama satu minggu. Sebelum percobaan, tikus putih dipuasakan selama 10 jam dengan tetap diberikan air minum.
Besarnya ulangan pada setiap perlakuan pada penelitian ini berdasarkan rumus Federer (1963) dalam Kusriningrum (2010) :
Keterangan :
t = banyaknya perlakuan n = banyaknya ulangan
Maka banyaknya ulangan pada penelitian ini adalah : 5 (n – 1) ≥ 15
5n – 5 ≥ 15
n ≥ (15 + 5) / 5
n ≥ 4
3.5 Metode Penelitian 3.5.1 Persiapan hewan coba
Hewan coba berupa tikus putih (Rattus norvegicus) jantan dengan berat badan 150-200 gram, berumur tiga bulan, dan berjumlah 20 ekor dimasukkan ke dalam lima buah kandang berukuran 40 cm x 60 cm. Tiap kandang diisi empat ekor tikus putih yang di pilih secara acak. Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu dengan tujuan untuk meminimalisir efek stres pada tikus putih yang dapat
berpengaruh pada metabolisme tubuh dan dapat mengganggu penelitian karena berada di lingkungan yang baru. Tikus putih yang digunakan dalam penelitian ini harus sehat dengan tanda-tanda bulu normal, warna putih bersih, mata jernih, tingkah laku normal dan tidak terdapat kelainan atau cacat tubuh. Selama diadaptasikan tikus putih diberi pakan ayam dan minum ad libitum.
3.5.2 Pembuatan ekstrak bawang merah
Sebanyak 8000 gram bawang merah dikupas dan diiris tipis lalu di keringkan dengan cara diangin-anginkan dalam suhu kamar sampai menjadi simplisia. Simplisia merupakan bahan baku alamiah yang digunakan untuk membuat ramuan obat tradisional yang belum mengalami pengolahan apapun kecuali proses pengeringan. Simplisia bawang merah dihaluskan dengan cara digiling menjadi serbuk. Serbuk yang diperoleh kemudian diekstrasi dengan cara maserasi dengan merendam pada pelarut etanol 96%, kemudian disaring hingga menghasilkan filtrat. Filtrat lalu di ekstraksi dalam rotavapour pada suhu 50˚C dengan kecepatan 40 rpm, hingga diperoleh ekstrak bawang merah yang kental dan berwarna coklat kehitaman. Hasil ekstrak tersebut diencerkan dengan menggunakan CMC Na 0,5% kemudian dilakukan perhitungan sesuai dosis pada setiap perlakuan.
3.5.3 Penetapan dosis ekstrak bawang merah
Penetapan dosis ekstrak Bawang Merah (Allium ascalonicum) pada penelitian ini berdasarkan pada penelitian sebelumnya. Pada penelitian Aryanti dan Linda (2010) didapatkan dosis efektif untuk menurunkan kadar glukosa darah pada tikus putih (Ratus norvegicus) yaitu 300 mg/kg BB dengan perlakuan
pemberian glukosa untuk membuat kondisi hiperglikemia, yang selanjutnya dosis efektif ini akan dijadikan sebagai acuan dosis tengah.
Dengan pertimbangan pada penelitian Aryanti dan Linda (2010) bahwa aloksan memiliki kenaikan kadar glukosa darah yang lebih tinggi daripada glukosa, maka dosis tengah yang akan digunakan pada penelitian ini dinaikkan menjadi 500 mg/kg BB, untuk dosis terendah diambil 250 mg/kg BB dan dosis tertinggi diambil 750 mg/kg BB. Dengan demikian dosis pemberian ekstrak bawang merah pada penelitian ini adalah 250 mg/ kg BB, 500 mg/kg BB dan 750 mg/ kg BB.
3.5.4 Penetapan dosis aloksan
Menurut (Nugroho, 2006) tikus hiperglikemik dapat dihasilkan dengan menginjeksikan aloksan dengan dosis 120 – 150 mg/kg BB secara intraperitonial. Sehingga dosis aloksan yang diperlukan untuk satu ekor tikus putih dengan berat badan 150 gram adalah :
x 120 mg/kg BB = 18 mg/150 gram BB 3.5.5 Penentuan Dosis Metformin
Dosis metformin yang lazim digunakan untuk menimbulkan efek hipogligemik terhadap kadar glukosa darah berdasarkan literatur adalah 500 mg – 2,25 gram per hari pada manusia yang mempunyai berat badan 70 kg yang diberikan secara oral dengan dosis tunggal (Katzung, 2007). Maka dilakukan perhitungan dosis sebagai berikut :
Dosis metformin = Dosis teoritis x faktor konversi tikus = 500 mg x 0,018
= 9 mg/ 200 gram BB atau 45 mg/kg BB
3.5.6 Pengukuran kadar glukosa darah
Pengukuran kadar glukosa darah pada tikus putih (Rattus norvegicus) dilakukan dengan menggunakan alat glucometer merk EasyTouch. Cara pengambilan darah yaitu bersihkan ekor dengan kapas yang diberi air agar kotoran yang melekat hilang, lalu bersihkan kembali dengan alkohol 70%. Pangkal ekor ditusuk dengan jarum kecil, darah yang keluar kemudian disentuhkan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah akan terbaca di layar setelah 10 detik dan dinyatakan dalam mg/dl. Pengukuran kadar glukosa darah tikus di ukur sebelum perlakuan dan empat hari setelah pemberian aloksan.
3.5.7 Perlakuan
Penelitian ini dilakukan secara in vivo terhadap 20 ekor tikus putih jantan galur wistar yang dibagi menjadi lima kelompok perlakuan, tiap kelompok berisi empat ekor tikus putih. Perlakuan terdiri dari K-, K+, P1, P2, P3.
Pada hari pertama seluruh tikus putih diukur kadar glukosa darahnya untuk memastikan kadar glukosa darah normal. Selanjutnya seluruh tikus putih diinduksi aloksan dosis 18 mg / 150 gram BB secara intraperitoneal. Pemberian aloksan dilakukan satu kali pada hari pertama perlakuan. Setelah empat hari dari proses induksi aloksan (untuk mendapatkan kenaikan kadar glukosa darah konstan) kemudian diukur kembali kadar glukosa darahnya. Setelah terjadi kenaikan kadar glukosa darah, pada kelompok K- diberikan CMC Na 0,5% lalu
pada kelompok K+ diberikan metformin dosis 45 mg/kg BB, sedangkan kelompok P1, P2, P3 diberikan ekstrak bawang merah dengan dosis 250 mg/kg BB, 500 mg/kg BB, 750 mg/kg BB. Pada penelitian Martia (2015) pemberian terapi selama 14 hari dengan penggunaan metformin dan ekstrak air Cynodon dactylon dapat memberikan efek terapi yang baik, dan selanjutnya dijadikan sebagai acuan lama pemberian terapi selama 14 hari.
Perlakuan pada hewan coba dilakukan sebagai berikut :
K- : Kontrol negatif diinduksi aloksan 18 mg/ 150 gram BB (satu kali injeksi intraperitoneal) dan pemberian larutan CMC Na 0,5% (peroral) selama 14 hari
K+ : Kontrol positif diinduksi aloksan 18 mg/ 150 gram BB (satu kali injeksi intraperitoneal) dan pemberian metformin 45 mg/kg BB (peroral) selama 14 hari
P1 : Perlakuan 1 diinduksi aloksan 18 mg/ 150 gram BB (satu kali injeksi intraperitoneal) dan pemberian ekstrak bawang merah dengan dosis 250 mg/kg BB (peroral) selama 14 hari
P2 : Perlakuan 2 diinduksi aloksan 18 mg/ 150 gram BB (satu kali injeksi intraperitoneal) dan pemberian ekstrak bawang merah dengan dosis 500 mg/kg BB (peroral) selama 14 hari
P3 : Perlakuan 3 diinduksi aloksan 18 mg/ 150 gram BB (satu kali injeksi intraperitoneal) dan pemberian ekstrak bawang merah dengan dosis 750 mg/kg BB (peroral) selama 14 hari
3.6 Prosedur Pengambilan Data
3.6.1 Pembuatan preparat histopatologi
Setelah dilakukan perlakuan pada tikus putih tahap selanjutnya dilakukan euthanasia. Euthanasia dilakukan dengan menggunakan chloroform, kemudian dilakukan pembedahan terhadap tikus putih untuk diambil organ hepar.
Hepar yang telah diambil lalu di fiksasi pada suatu tempat yang berisi larutan BNF 10%. Setelah itu, dilakukan pembuatan preparat histopatologi menggunakan pewarnaan Haematoxylin Eosin (HE). Pembuatan preparat histopatologi dilakukan di Gedung Diagnostic Center RSUD Dr. Soetomo Surabaya.
3.6.2 Pemeriksaan preparat histopatologi
Pemeriksaan preparat histopatologi hepar menggunakan mikroskop. Pemeriksaan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran 400 kali terhadap lima lapangan pandang yang berbeda untuk tiap slide. Kriteria penilaian untuk mengetahui seberapa berat perubahan histopatologi hepar tikus putih pada tiap preparat menggunakan metode scoring Brunt (2000). (Tabel 3.1).
Tabel 3.1 Skoring penilaian derajat histopatologi sel hepar (Brunt et al., 2000)
Degenarasi Nekrosis None 0 0 Minimal (0-25%) 1 1 Mild (25-50%) 2 2 Moderate (50-75%) 3 3 Severe (75-100%) 4 4
3.7 Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil skoring gambaran histopatologi hepar dianalisa dengan uji Kruskall-Walis dan bila terdapat perbedaan yang nyata diantara kelompok perlakuan (p<0,05), maka dilanjutkan dengan uji Mann- Whitney (Daniel, 1991). Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SPSS for windows 20.
3.8Diagram Alur Penelitian
20 ekor tikus putih (Rattus norvegicus) jantan diadaptasikan selama 1 minggu
Dipuasakan 10 jam, pengukuran kadar glukosa darah untuk memastikan kadar glukosa darah tikus putih normal
K+
K- P1 P2 P3
Diinduksi aloksan 18 mg / 150 gram BB satu kali (intraperitoneal) sebanyak 0,5 ml
Dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah untuk memastikan tikus hiperglikemia
Euthanasia
Pemeriksaan histopatologi hepar
Analisis data K+ Metformin 45 mg/kg BB K- CMC Na 0,5 % P2 Ekstrak bawang merah 500 mg/kgBB P1 Ekstrak bawang merah 250 mg/kgBB P3 Ekstrak bawang merah 750 mg/kgBB