3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di kandang hewan coba Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga sebagai tempat pemeliharaan ular dan Laboratorium Patology Veteriner untuk membuat sediaan preparat mikroskopis luka insisi. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2014 sampai bulan Maret 2015.
3.2 Bahan dan Materi Penelitian 3.2.1 Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah ular sanca batik (Python reticulatus) berumur enam bulan, berat rerata 300 gram, panjang rerata dua meter. Hewan coba diperoleh dari pengepul dari Bogor dan Banten.
3.2.2 Bahan Penelitian
Beberapa bahan penelitian yang digunakan adalah Betadine sebagai media
pembanding, dan lendir bekicot sebagai media pengobatan yang diperoleh dengan cara memecah cangkang bekicot pada bagian ujungnya yang lancip kemudian ditampung dengan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kapas Alkohol digunakan untuk membersihkan daerah yang akan diinsisi sebelum diberikan Lidokain untuk anastesi daerah yang akan diinsisi.
3.2.3 Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah kandang hewan coba berupa kandang kelompok perlakuan yang terbuat dari plastik berbentuk lemari yang mempunyai lima laci, keranjang buah dengan penutupnya, glove tebal, hook,
tabung reaksi, scalpel, penggaris, spuit, plester luka, pipet, object glass, cover glass dan mikroskop.
3.2.4 Besar sampel
Besar sampel yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan rumus Federer (1963) dalam Kusriningrum (2008) :
- t = kelompok perlakuan
- n = jumlah sampel
Dengan menggunakan rumus di atas, penelitian ini menggunakan 2 perlakuan sehingga didapatkan jumlah ulangan minimal 8 ekor ular sanca batik dan secara keseluruhan membutuhkan minimal 16 ekor ular sanca batik.
3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Jenis penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental laboratotik. Penelitian ini dilakukan untuk mengamati uji aktivitas lendir bekicot (Achatina fulica) terhadap tingkat kesembuhan luka insisi secara makroskopis dan mikroskopis pada ular sanca batik (Python reticulatus).
3.3.2 Variabel Penelitian
- Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah Betadine (mengandung povidone
iodine 10%) dan lendir bekicot.
- Variabel tergantung
Variable tergantung pada penelitian ini adalah skor penilaian kesembuhan luka secara makroskopis dan mikroskopis.
- Variabel kendali
Variable terkendali pada penelitian ini adalah umur, berat badan ular sanca
batik (Python reticulatus), tatalaksana pemeliharaan, dan pembuatan
hewan coba.
3.3.3 Definisi Operasional Variabel
- Lendir bekicot diperoleh dari memecah bagian ujung cangkang bekicot
yang akan keluar lendir dan ditampung ke dalam tabung reaksi.
- Kesembuhan luka diindikasikan dengan penutupan luka oleh jaringan
epitel sama tingginya dengan kulit sekitar luka dan terkelupasnya jaringan nekrotik (Pengamatan makroskopis).
- Inflamasi ditandai dengan adanya bengkak dan nanah yang dapat dilihat
padapengamatan makroskopis
- Granulasi ditandai dengan adanya pembentukan pembuluh darah baru dan
pembentukan serabut fibrin pada daerah sekitar luka sehingga luka akan tampak berwarna merah pada pengamatan makroskopis
- Maturasi merupakan serangkaian proses penyembuhan yang ditandai
dengan menutupnya luka, serta sudah tidak adanya infeksi dan granulasi
- Kolagen merupakan protein terbanyak pada jaringan tubuh, termasuk kulit.
Kolagen dapat dilihat melalui pewarnaan HE sebagai zona rangkaian serabut berwarna merah muda.
- Epitelisasi merupakan proses pembentukan epitel baru pada jaringan yang
- Angiogenesis adalah pembentukan pembuluh darah baru yang ampak berupa kapiler dengan sedikit sisa eritrosit. Dapat dilihat melalui pewarnaan HE sebagai japiler dengan sisa eritrosit yang berwarna merah.
- Sel fibroblas adalah proses pembentukan jaringan ikat. Dapat dilihat
melalui pewarnaan HE sebagai zona sebabut berwana merah.
3.4 Perlakuan
Penelitian ini digunakan hewan coba ular sanca batik betina (Python
reticulatus) sebanyak 16 ekor yang diadaptasikan terlebih dahulu selama seminggu. Selama adaptasi diberikan makanan dan minuman secukupnya, serta melakukan pemeriksaan dan perawatan kesehatan.
Setelah masa adaptasi, ular sanca batik dikelompokkan secara acak secara terbagi menjadi dua kelompok perlakuan dengan setiap kelompok tiap delapan replikasi. Hari ke sepuluh akan dilakukan pengamatan makroskopis berdasarkan skoring makroskopis dan akan dilakukan pembuatan preparat yang kemudian dilakukan pengamatan mikroskopis berdasarkan skoring mikroskopis.
Sebelum dilakukan insisi untuk pembuatan luka, kapas Alkohol dioleskan pada bagian kulit yang akan di anastesi, kemudian di berikan Lidokain (100 mg/kg BB) secara intra muscular dan di tunggu selama tiga menit agar ular tersebut teranastesi. Insisi dilakukan pada sepertiga panjang tubuh dari kepala ular sepanjang 2 cm dan kedalaman 0,3 cm. Kapas Alkohol diberikan terlebih dahulu
untuk membersihkan daerah muskulus yang akan diinsisi kemudian Scalpel
ditegakkan dengan jari telunjuk dan ibu jari tangan kiri bertindak sebagai
pada tangan kanan dan dengan membentuk sudut 30 – 40° dengan kulit. Insisi dilakukan dengan menarik scalpel ke arah caudal (Asali, 1993).
Pengobatan dilakukan secara topical setelah 24 jam. Luka menunjukkan gejala positif berupa keradangan akut dan nanah berwarna putih kekuningan. Pengobatan dilakukan sehari sekali hingga terjadi kesembuhan luka dan pengelupasan keropeng (Umar dkk., 2012). Pengobatan dilakukan dengan
mengoleskan betadine (mengandung povidone iodine 10%) pada P1 dan lendir
bekicot pada P2.
Pengambilan sampel dilakukan dengan cara kulit ular yang sudah diinsisi di oleskan kapas alkohol kemudian diberikan Lidokain pada empat sisi yang dilebihkan 1 cm dari sisi kanan, kiri, atas, dan sisi bawah pada bagian luka insisi dan ditunggu selama sepuluh menit agar ular teranastesi. Kemudian jaringan kulit di ambil dengan scalpel pada kedalaman 0,3 cm dan dilebihkan 1 cm dari sisi kanan, kiri, atas, dan sisi bawah pada bagian luka insisi ular untuk kemudian dibuat preparat histopatogy.
3.5 Penilaian Penyembuhan Luka
Penilaian penyembuhan luka insisi secara makroskopis pada kedua perlakuan. Penilaian ini berdasarkan adanya kemerahan, bengkak dan exudat
(Nisbet et al.,2010).
Penilaian penyembuhan luka insisi secara mikroskopis dilakukan pada daerah penyembuhan (healing center). Penilaian kedua perlakuan dapat di lihat berdasarkan tabel 3. 1 (Nisbet et al.,2010).
Variabel dan Deskripsi Skor Kolagen - Tidak ada 0 - Kurang 1 - Sedang 2 - Banyak 3 Epitelisasi - Tidak ada 0 - Sebagian 1
- Lengkap, tetapi belum sempurna 2
- Lengkap dan matang 3
Angiogenesis
- Tidak ada 0
- 1-5 pembuluh darah/lapang pandang perbesaran 400x 1
- 6-10 pembuluh darah/lapang pandang perbesaran 400x 2
- Lebih dari 10 pembuluh darah/lapang pandang 3
Perbesaran 400x Sel fibroblas
- Tidak ada 0
- Beberapa fibroblast 1
- Fibroblas lebih banyak 2
- Didominasi oleh fibroblast 3
Keterangan : hasil skor tinggi menunjukkan hasil yang lebih baik pada pemeriksaan mikroskop
3.6 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) sebanyak tiga perlakuan dengan setiap perlakuan enam ekor yang di amatai
setelah lima hari dan 10 hari. Maka untuk menentukan ulangan dalam penelitian
t ( n – 1 ) ≥ 15 2 ( n – 1 ) ≥ 15 2n – 2 ≥ 15 2n ≥ 17 n ≥ 8,5 n ≥ 8 3.7 Analisis Data
Data hasil pengamatan uji aktivitas lendir bekicot (Achatina fulica) terhadap tingkat kesembuhan luka insisi secara makroskopis dan mikroskopis
pada ular sanca batik (Python reticulatus) yang sudah diberi skor kemudian diolah
dengan penilaian peringkat (rank) lalu dianalisis dengan uji statistic
nonparametric dengan Chi-Square Tests untuk mengetahui data penilaian
makroskopis dengan hasil positif atau negatif pada perbandingan kedua perlakuan.
Data penilaian mikroskopis akan dianalisis dengan Mann-Withney Test pada
tingkat signifikasi 5% untuk mngetahui kelompok mana yang memberikan hasil berbeda nyata. Analisis statistic dilakukan dengan menggunakan propgram SPSS for windows 20.
3.8 Diagram Alir Penelitian
Adaptasi Kandang dan Lingkungan ( 1 Minggu)
Hari ke sepuluh
Pengamatan makroskopis dan mikroskopis pembuatan preparat
P.2
8 ekor ular sanca batik (Python reticulatus)
Di beri Lendir bekicot
(Achatina fulica)
Analisis data Koleksi data
16 Ekor ular sanca batik (Python reticulatus)
P.1
8 ekor ular sanca batik (Python reticulatus)
Di beri betadine
P.1
8 ekor ular sanca batik (Python reticulatus)
Di beri betadine
P.2
8 ekor ular sanca batik (Python reticulatus)
Di beri Lendir bekicot
(Achatina fulica)
Pengobatan 1 x 1 selama 10 hari
29
