Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Agustus 2010 sampai April 2011 di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi dan Laboratorium Ilmu Nutrisi Ternak Perah, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Materi Alat
Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian tersebut antara lain: autoclave, sentrifus, kantong plastik tahan panas, tabung sentrifus, termos, kain penyaring,
shaker waterbath, labu Erlenmeyer, oven 60 °C, gegep, sudip, magnetic stirrer,
tabung fermentor, tutup karet, pipet Mohr, bulp, timbangan digital, gelas ukur, spatula, pengaduk kaca, counting chamber, botol Schott, mikroskop cahaya, tabung reaksi, freezer, roller tube, spoit.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cairan rumen, tepung terigu, agar-agar, larutan mineral mikro, larutan McDougall, larutan resazurin 0,1%, gas CO2, garam formalin (formal-saline), K2HPO4, NaCl, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, CaCl2, Na2CO3, cystein-HCl, Na2HPO4, KCl, tricloro acetic acid (TCA) dan
sulfo salicylic acid (SSA), media tepung brain heart infusion (BHI), carboxy methyl cellulose (CMC), kasein, susu skim, pati, agar, glukosa, larutan hemin 0,05% dan vitamin, aquades.
Prosedur Pembuatan Biomineral (Tjakradidjaja et al., 2007)
Cairan rumen yang digunakan diperoleh dari rumah potong hewan (RPH) yang ada di kandang A, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Cairan rumen diendapkan dengan larutan HCl 0,1 N hingga pHnya menjadi 5,5, kemudian disaring. Bahan carier berupa tepung terigu dan ditambahkan agar-agar kemudian dikeringkan selama 2-3 hari dengan panas matahari atau menggunakan oven 60 °C. Setelah kering, bahan tersebut digiling sampai menjadi tepung biomineral seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 1, kemudian dianalisis kandungan mineralnya. Untuk lebih jelasnya, prosedur pembuatan biomineral dapat dilihat pada Gambar 2.
16
Gambar 1. Biomineral dari Cairan Rumen Penambahan Mineral Makro
Pencampuran mineral Ca, P, Mg, dan S ke dalam tepung biomineral dilakukan secara manual dengan sendok sampai tercampur semua. Sumber mineral yang ditambahkan adalah CaCO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, dan K2HPO4.
Fermentasi in vitro Biomineral (Tilley dan Terry (1963) yang dimodifikasi oleh Sutardi (1979))
Tabung fermentor diisi dengan 1 g biomineral, 12 ml larutan buffer McDougall dengan pH 6,9 dan 8 ml cairan rumen segar. Tabung lalu dikocok dan
dimasukkan ke dalam shaker waterbath pada suhu 39 oC untuk menciptakan suasana
yang hampir sama dengan kondisi rumen dengan dialiri CO2 selama 30 detik dan ditutup dengan karet berventilasi. Penelitian ini akan mengamati waktu inkubasi 0 dan 3 jam, sehingga pada waktu-waktu tersebut dari dalam tabung fermentor diambil masing-masing 0,05 ml sampel dan dimasukkan kedalam media stok untuk
perhitungan populasi bakteri, 1 ml dimasukkan kedalam larutan triphan blue formal
saline (TBFS) untuk perhitungan populasi protozoa, dan 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi larutan pengencer untuk perhitungan sintesis protein mikroba. Saat pengambilan sampel dari tabung fermentor harus terus dialiri CO2 agar tetap dalam suasana anaerob sehingga mikrobanya tidak mati.
17 Cairan rumen
Diendapkan dengan larutan HCl 0,1 N hingga pH 5,5
Disaring
Endapan cairan rumen
Ditambahkan agar dan tepung terigu sebagai bahan carrier
Dikeringkan dengan panas matahari atau dalam oven 60°C selam 2-3 hari
Digiling
Tepung Biomineral
Gambar 2. Proses Pembuatan Biomineral (Tjakradidjaja et al., 2007) Perhitungan Populasi Protozoa (Ogimoto dan Imai, 1981)
Sebanyak 1 ml sampel cairan sampel hasil inkubasi ditambah 1 ml larutan garam formalin (formal saline). Larutan garam formalin dibuat dari campuran formalin 4% ditambah dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% dalam 100 ml larutan. Sebanyak ± 2 tetes campuran tersebut lalu ditempatkan pada counting chamber
dengan ketebalan 0,1 mm, luas kotak terkecil 0,0625 mm2 yang terdapat 16 kotak dan jumlah kotak yang dibaca sebanyak 5 kotak. Perhitungan populasi protozoa
18 dilakukan dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran 100 kali. Populasi protozoa dapat dihitung dengan rumus :
Protozoa/ml cairan rumen =
5) x 16 x 0,0625 x (0,1 FP x C x 1000
C = Jumlah protozoa terhitung FP = Faktor pengenceran
Perhitungan Populasi Bakteri Total, Selulolitik, Amilolitik dan Proteolitik (Ogimoto dan Imai, 1981)
Medium tumbuh yang digunakan untuk menghitung populasi bakteri total
adalah medium BHI, yaitu campuran dari tepung BHI3,7 g, glukosa 0,05 g, CMC 1
ml, pati (starch) 0,05 g, cystein-HCl 0,05 g, hemin 0,5 ml, resazurin 0,05 ml, dan aquades sampai 100 ml. Campuran medium tersebut dipanaskan perlahan-lahan sambil dialiri gas CO2 sampai terjadi perubahan warna dari kekuningan menjadi merah dan berubah lagi menjadi kuning bening, lalu didinginkan. Selanjutnya medium dimasukkan ke dalam tabung Hungate sebanyak 5 ml yang sebelumnya telah diisi agar Bacto sebanyak 0,15 g. Medium disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 ºC selama 15 menit dengan tekanan 1,2 Kgf/cm3.
Pada prinsipnya komposisi dan pembuatan medium untuk penghitungan populasi bakteri amilolitik, selulolitik dan proteolitik sama dengan untuk penghitungan populasi bakteri total. Perbedaan terdapat pada penggunaan sumber nutrien yang disesuaikan dengan jenis bakteri tersebut. Bahan medium tumbuh bakteri selulolitik adalah medium BHI ditambah dengan CMC 10 ml per 100 ml medium. Bahan medium tumbuh bakteri amilolitik adalah medium BHI ditambah dengan pati 0,05 g per 100 ml medium. Bahan medium tumbuh bakteri proteolitik adalah susu skim 1 g ditambahkan ke dalam 100 ml medium BHI.
Sampel diencerkan terlebih dahulu dengan medium pengencer sebelum dikulturkan. Pengenceran dilakukan dengan cara berikut : 0,05 ml cairan rumen dimasukkan ke dalam 4,95 ml medium pengencer pertama. Selanjutnya diambil kembali 0,05 ml lalu dimasukkan ke dalam 4,95 ml medium pengencer kedua. Dari pengencer kedua diambil kembali 0,05 ml lalu dimasukkan ke media pengencer tiga. Hal yang sama juga dilakukan pada pengencer keempat. Seluruh pengenceran ini diikuti dengan homogenisasi. Dengan demikian di dalam pengenceran satu sampai
19 empat masing-masing mengandung bakteri 102, 104, 106, dan 108 CFU/ml. Pengenceran tersebut dilakukan sampai 4 kali (4 seri tabung). Dari masing-masing seri tabung pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml, lalu diinokulasikan ke medium agar dan dihomogenkan dengan diputar sambil dialiri air, sehingga medium dapat memadat secara merata. Tabung yang telah diinokulasi lalu diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 39 oC selama 24 jam. Populasi bakteri total, selulolitik, amilolitik, dan proteolitik dapat dihitung dengan rumus :
Populasi bakteri = n x 10x/0,05 x 0,1 CFU/ml
n = jumlah koloni yang terdapat pada tabung seri pengenceran ke-x
Perhitungan Sintesis Protein Mikroba (Shultz & Shultz, 1969)
Perhitungan protein yang berupa non protein nitrogen (NPN) diukur dengan menggunakan TCA dan SSA. Larutan yang akan digunakan dibuat dengan mencampurkan larutan TCA 20% dan larutan SSA 2% dengan proporsi 50:50. Sebanyak 1 ml cairan sampel hasil inkubasi dicampur dengan larutan TCA dan SSA, kemudian larutan ini dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit. Larutan tersebut lalu disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan endapan ditambah dengan aquades (3 ml), kemudian ditambahkan 6 ml campuran TCA-SSA. Campuran ini dihomogenkan lagi dengan vortex selama 2 menit, kemudian disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatannya dibuang dan endapannya dianalisis dengan metode mikro Kjehldal.
Rancangan Percobaan Perlakuan
Perlakuan yang diterapkan meliputi dua faktor. Faktor A adalah suplementasi mineral makro (Ca, P, Mg, dan S) pada biomineral dengan tingkat pemberian 0, 0,5, 1, 1,5, dan 2 kali taraf kebutuhan mineral sapi potong (Angus) yang direkomendasikan oleh NRC (2000). Faktor A adalah sebagai berikut :
A1= Biomineral + 0 x kebutuhan mineral Ca, P, Mg, dan S sesuai NRC (2000) A2= A1 + 0,5 x kebutuhan mineral Ca, P, Mg, dan S sesuai NRC (2000) A3= A1 + 1 x kebutuhan mineral Ca, P, Mg, dan S sesuai NRC (2000) A4= A1 + 1,5 x kebutuhan mineral Ca, P, Mg, dan S sesuai NRC (2000) A5= A1 + 2,0 x kebutuhan mineral Ca, P, Mg, dan S sesuai NRC (2000)
20 Faktor B adalah waktu inkubasi cairan rumen secara in-vitro, sebagai berikut : B1= waktu inkubasi 0 jam
B2= waktu inkubasi 3 jam
Tabel 4 menunjukkan kandungan mineral dalam biomineral cairan rumen yang telah diteliti oleh Suganda (2009) dan Tabel 5 adalah mineral makro yang ditambahkan pada perlakuan.
Tabel 4. Kandungan Mineral Biomineral
Mineral Jumlah P (% BK) 0,29 K (% BK) 0,16 Ca (% BK) 0,31 Mg (% BK) 0,09 Na (% BK) 0,42 S (% BK) 0,25 Fe (ppm) 717 Al (ppm) 1343 Mn (ppm) 50 Cu (ppm) 7 Zn (ppm) 147 Co (ppm) 0,3 Ni (ppm) 1,3 Cr (ppm) 3 Se (ppm) 32,5 Keterangan : Suganda (2009)
21 Tabel 5. Pemberian Mineral Makro pada Perlakuan
Mineral Kebutuhan NRC (%) Taraf Pemberian (%) 0 x NRC 0,5 x NRC 1 x NRC 1,5 x NRC 2 x NRC Ca 0,33 0 0,165 0,33 0,495 0,66 P 0,20 0 0,10 0,20 0,30 0,40 Mg 0,12 0 0,06 0,12 0,18 0,24 S 0,15 0 0,075 0,15 0,225 0,30 Model
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak kelompok (RAK) berpola faktorial 5 x 2. Faktor A taraf pemberian mineral Ca, P, Mg, dan S 0 x, 0,5 x, 1 x, 1,5 x, dan 2 x kebutuhan NRC (2000) yang ditambah ke dalam biomineral dan kontrol. Faktor B adalah waktu inkubasi, 0 dan 3 jam. Cairan rumen sapi potong dengan mineral sebagai ulangan atau kelompok. Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut :
Yijk = µ + i+ αj + ßk + αjßk + εijk
Keterangan :
Yijk = nilai pengamatan kelompok ke-i, perlakuan ke-j, dan waktu inkubasi
ke-k
µ = nilai rataan umum
i = pengaruh kelompok (cairan rumen) ke-i
αj = pengaruh perlakuan perbaikan mutu biomineral ke-j
ßk = pengaruh perlakuan waktu inkubasi ke-k
αjßk = pengaruh interaksi
εijk = galat percobaan untuk kelompok ke-i, pengaruh perlakuan mineral makro ke-j dan pengaruh perlakuan waktu inkubasi ke-k
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan untuk mengetahui perbedaan antara perlakuan diuji dengan ortogonal kontras (Steel dan Torrie, 1993).
Peubah
22
1) Populasi protozoa total yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
2) Populasi bakteri total yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
3) Populasi bakteri selulolitik yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
4) Populasi bakteri proteolitik yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
5) Populasi bakteri amilolitik yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
23
HASIL DAN PEMBAHASAN