A. Deskripsi
Berbagai kendala dihadapi pada budidaya kerang/tiram untuk memperoleh kelangsungan hidup dan pertumbuhan kerang yang baik, salah satu diantaranya yang mendapat perhatian utama adalah serangan hama dan penyakit yang dapat mempengaruhi produksi kerang tersebut. Sebagian besar serangan hama penyakit pada kerang disebabkan karena kompetitor (penyaing), pemangsa (predator) dan perusak cangkang kerang. Belum banyaknya informasi tentang serangan penyakit terhadap kerang tidak berarti bahwa tidak ada kasus serangan penyakit terhadap kerang, tetapi karena budidaya kerang masih dalam tahap pengembangan (seperti kerang abalone ) sehingga belum ada informasi tentang hasil penelitian yang lebih mengarah kepada hama dan penyakit kerang dan teknik pengembangannya. Jamur merupakan salah satu patogen penting yang dapat menginfeksi abalone. Pengaruhnya terhadap moluska diantaranya adalah : merupakan patogen yang ganas (menimbulkan kematian sampai 100%) pada stadia larva dan post larva dalam usaha pembenihan, merusak telur, secondary invander yang dapat merusak struktur cangkang, agen berbahaya bagi juvenil bahkan moluska dewasa baik yang di alam maupun di wadah budidaya.
B. Kegiatan Belajar
1. Tujuan Pembelajaran
Setelah mempelajari materi ini siswa dapat :
a. Menjelaskan gejala serangan hama dan penyakit kerang b. Memahami prosedur pemeriksaan kerang sakit
c. Menerapkan teknik pencegahan penyakit kerang d. Menerapkan teknik pengobatan kerang sakit
2. Uraian Materi
Hama dan penyakit dapat menyebabkan proses budidaya menjadi gagal, pertumbuhan kerang dapat terganggu bahkan dapat mematikan kerang yang dibudidayakan, untuk itu perlu dilakukan pengendalian. Kunci utama dalam pengendalian hama dan penyakit ikan adalah melalui penerapan biosecurity
untuk menjaga keamanan pangan (food safety) dan ramah lingkungan (eviromental friendly). Keamanan biologi atau lebih dikenal dengan biosecurity
merupakan upaya mencegah atau mengurangi peluang masuknya penyakit kerang ke suatu sistem budidaya dan mencegah penyebaran dari satu tempat ke tempat lain yang masih bebas. Namun demikian pada kenyataannya prinsip
biosecurity belum sepenuhnya diterapkan pada kegiatan budidaya kekerangan.
Kondisi ini berbanding terbalik jika dibandingkan pola manajemen budidaya yang dilakukan di negara asing yang teknologi budidayanya sudah sangat maju seperti: Thailand, China dan Jepang, prinsip biosecurity menjadi pertimbangan utama sebagai penentu keberhasilan budidaya. Pembudidaya seringkali belum menyadari bahwa pengelolaan air bukan hanya dilakukan pada air pada lokasi budidaya, namun pengelolaan air buangan budidayapun yang sangat penting untuk mencegah penyebaran hama dan penyakit kerang terhadap lokasi budidaya disekitarnya. Oleh karena itu perlu ditanamkan terhadap para pembudidaya perikanan, sehingga ada komitmen dan tanggungjawab bersama dalam upaya pencegahan terhadap kemungkinan masuknya hama dan penyakit serta kemungkinan dampak penyebaran terhadap lingkungan budidaya disekitarnya.
Terdapat beberapa faktor yang diduga sebagai penyebab munculnya penyakit kerang sehingga menyebabkan kegagalan panen antara lain:
a. Kualitas benih yang rendah dan sudah terinfeksi penyakit
b. Kondisi Lingkungan tempat budidaya meliputi sumber air berkualitas rendah dan terkontaminasi oleh pathogen penyebab penyakit kerang.
c. Pengelolaan lingkungan budidaya selama pemeliharan yang kurang baik menyebabkan kualitas lingkungan perairan berkualitas rendah dan terjadi fluktuasi kualitas lingkungan perairan yang luas selama proses pemeliharaan menyebabkan kerang mengalami stress sehingga kondisi kerang melemah, yang pada akhirnya mudah terserang penyakit.
Mengamati
Bentuklah kelompok siswa dalam jumlah 4 – 5 orang
Lakukan kegiatan mencari informasi dari buku atau bahan ajar, internet, video dan lain-lain sehingga peserta didik bisa memahami pengendalian gejala serangan hama penyakit kekerangan.
Adapun informasi yang harus peserta didik cari adalah : a.Menjelaskan gejala serangan hama dan penyakit kerang b.Memahami prosedur pemeriksaan kerang sakit
Menanya
Lakukan diskusi antar kelompok dengan cara setiap kelompok bertukar informasi !
Bandingkan informasi yang peserta didik peroleh dengan informasi kelompok lain. Adakah
perbedaannya ? Jika ada, sebutkan !
Tuliskan kesimpulan peserta didik tentang jenis pakan dan kebiasaan makan kerang kepada guru !
a. Gejala serangan penyakit yang disebabkan karena hama dan peyakit infeksi serta non infeksi
Hama umumnya menyerang bagian cangkang. Hama tersebut berupa jenis teritip, racing, dan polichaeta yang mampu mengebor cangkang tiram. Hama yang lain berupa hewan predator, seperti gurita, bintang laut, rajungan, kerang hijau, teritip, golongan rumpu laut d an ikan sidat. Upayapencegahan dengan cara membersihkan hama-hama tersebut dengan manual pada periode waktu tertentu. Penyakit tiram mutiara umumnya disebabkan parasit, bakteri, dan virus. parasit yang sering ditemukan adalah Haplosporidium nelsoni. Bakteri yang sering menjadi masalah antara lain Pseudomonas enalia, Vibrio anguillarum, dan Achromobacter sp. Sementara itu, jenis virus yang biasanya menginfeksi tiram mutiara adalah virus herpes.
1) Hama Kerang
Hama merupakan hewan pengganggu dan pemangsa dalam pembenihan dan budidaya kerang. Meskipun tubuh kerang/tiram dilindungi oleh sepasang cangkang yang kuat, tetapi tidak cukup mampu untuk melindungi dari serangan hama yang mengganggu perkembangan kerang tersebut. Organisme ini biasanya akan menempel dan merusak, bahkan mematikan secara langsung atau pelan-pelan dengan cara mengambil pakan (kompetitor) yang dibutuhkan kerang atau memakan organ dalam kerang. Beberapa hama yang menyerang ini disebabkan oleh biofouling organisme (organisme penempel) maupun hama yang langsung memangsa kerang itu sendiri. Hama dari organisme penempel menyerang kerang secara tidak langsung karena sifatnya merusak dan kompetitor persaingan makanan sehingga kerang perlahan-lahan terganggu pertumbuhannya atau rusak cangkangnya dan akhirnya akan lemas dan mati.
Jenis hama kerang dari biofouling organisme (organisme penempel) antara lain bunga karang (boringsponge) seperti cliona sp dan porifera,
Cacing (boringworm) seperti polydora dan polychaeta, bivalvi
(boringbivalive) yang dapat membentuk seperti bliter di dalam cangkang, jenis teritip dan golongan kerang-kerang kecil (Teredo sp. dan
Manus sp.), keong bulu (anadara granasa) dan cacing. Jenis hama dari organisme lain yang juga sering dijumpai pada budidaya kerang adalah jenis tumbuhan (alga) misalnya : ganggang hijau (chloropyceaea) dan ganggang coklat (phaephyceae). Adapun hama yang langsung menyerang kerang terutama memangsa organ dalam yakni bintang laut, burung, dan kepiting. Hama kepiting merupakan pemangsa bagi juvenile dan kerang dewasa. Kepiting dapat menghabiskan satu lusin kerang dari jenis kerang hijau setiap harinya.
2) Penyakit Kerang
Penyakit didefinisikan sebagai segala sesuatu yang dapat menimbulkan gangguan suatu fungsi atau struktur dari alat-alat tubuh atau sebagian alat tubuh, secara langsung maupun tidak langsung (Kordi, 2004). Penyakit dapat disebabkan oleh faktor abiotik seperti kualitas air, serta faktor biotik seperti mikroorganisme yang menempel pada permukaan tubuh dan menginfeksi larva/benih (Sunaryo et al., 1978; Taslihan et al., 1991). Penyakit terjadi melalui proses hubungan antara tiga faktor yaitu kondisi lingkungan, kondisi inang dan adanya patogen. Adanya ketidakseimbangan cekaman atau stress menyebabkan mekanisme pertahanan diri yang dimiliki menjadi lemah dan akhirnya terjadi penyakit (Kordi, 2004).
Penyakit pada kerang/tiram biasanya timbul berkaitan dengan lemahnya kondisi kerang yang diakibatkan oleh beberapa faktor yaitu antara lain penanganan kerang selama budidaya, faktor pakan yang diberikan, dan keadaan lingkungan yang kurang mendukung. Pada
padat penebaran kerang yang tinggi jika faktor lingkungan kurang menguntungkan misalnya kandungan zat asam dalam air rendah, pakan yang diberikan kurang tepat baik jumlah maupun mutunya, penanganan kerang kurang sempurna, maka kerang akan menderita stress. Dalam keadaan demikian kerang akan mudah terserang oleh penyakit. Penyakit pada kerang masih belum banyak diteliti, namun dari beberapa pengamatan gejala serangan penyakit diduga dari jenis bakteri dan akibat terjangkit penyakit yang disebabkan oleh pencemaran perairan di atas ambang batas.
Secara umum ada lima kemungkinan penyebab kematian populasi kerang di wadah budidaya atau di perairan lain, yaitu
a) Pemangsaan hewan predator kerang.
b) Organisme penempel (biofoulling organisme) c) Stress lingkungan atau keracunan,
d) Infeksi mikroba (virus, bakteri, protozoa, dan fungi),
e) Infeksi metazoa (coelenterate, cestoda, nematoda, acantocephala, crustacea, dan lain-lain).
Stress mencakup semua spesies kerang dan dari semua kelompok umur. Infeksi mikroba ditandai dengan adanya radang atau luka di bagian luar (eksternal) atau bagian dalam (internal) tubuh kerang, pendarahan, pembengkakan, luka, perubahan warna kerang insang yang pucat, organ dalam yang rusak, dan lain-lain. Infeksi mikroba biasanya hanya terjangkit pada satu spesies dan kematian satu spesies dan kematian biasanya berjalan relatif cepat. Infeksi metazoa, baik yang bersifat ekto maupun yang endoparasit, biasa keduanya dapat dilihat dengan mata telanjang. Efek yang bersifat sublethal berkembang lambat, dan kematian juga lambat. Biasanya hanya satu spesies kerang yang terjangkit, dan kadang-kadang dari satu kelompok umur saja.
Jamur Lagenidium sp. merupakan salah satu jenis jamur dari kelas
Oomycetes yang juga patogen pada kerang dan beberapa hewan tak bertulang belakang (invertebrata) seperti lobster, kepiting, larva serangga (Nakamura, 1995). Infeksi Lagenidium sp. dapat menimbulkan kematian sampai 100% dalam waktu 2 hari, merusak telur sehingga tidak dapat menetas, dan menghambat proses pernafasan (Seafdec- AQD, 1990). Ada sekitar 27 spesies dalam genus ini diantaranya: L.
callinectes, L. caudatum, L. chthamalophilum, L. clavatum, L.
coenocyticum, L. contortum, L. cyclotellae, L. cylindriforme, L. elegans, L.
enecans, L. entophytum, L. entosphaericum, L. giganteum, L. globosum, L.
gracile, L. humanum, L. alat, L. microsporum, L. myophilum, L. oophilum,
L.pyriforme, L. rabenhorstii, L. scyllae, L. syncytiorum, L. thermophilum, L.
tortum, L. zopfii.
Infeksi dari Lagenidium myophilum ditemukan pada otot perut udang
Pandalus borealis di Jepang. L. callinectes juga berhasil diisolasi dari telur kepiting biru Callinectes sapidus. L. chthamalophilum merupakan parasit pada udang. Infeksi dari spesies Lagenidium juga menyerng larva dari udang putih Penaeus seriferus, lobster Amerika, Homarus americanus (Nakamura et al, 1994). Berikut ini beberapa spesies dari
Lagenidium sp.
a) Lagenidium myophilum
Jamur ini termasuk ke dalam jenis halocarpik dan endobiotik. Ukuran zoospora , x .3 μm. Jamur ini bersifat patogen pada udang dari genus Pandalus yang hidup di perairan laut dalam, dapat menyerang pada berbagai tingkat dari larva sampai pada udang dewasa (Nakamura et al, 1994).
b) Lagenidium giganteum
Lagenidium giganteum pada awalnya diisolasi dari larva nyamuk di North Carolina dan Georgia. Hidup pada air tawar dan tidak cocok
pada lingkungan laut. Habitat yang cocok ada pada tempat nyamuk bertelur, sistem drainase, kolam, bak-bak air dan aliran sungai. Jenis jamur ini tidak selalu menjadi parasit, tetapi juga saprofit (misalnya, pada serangga mati) karena kondisi alam. Parasit ini telah didokumentasikan terutama di bagian selatan Amerika Serikat, California, Kuba, Kolombia, dan Inggris. Jamur ini mati pada temperatur di bawah 16°C atau diatas 32°C.
c) Lagenidium callinectes
Lagenidium callinectes juga merupakan salah satu spesies dari genus
Lagenidium ini. Spesies ini juga menyerang beberapa hewan seperti udang dari jenis Penaeus monodon Fabricius dan lobster. Hal ini berdampak pada rusaknya selaput telur sehingga menjadi keras dan tidak bisa menetas.
3) Pemeriksaan kerang sakit
Penyakit yang menyerang kerang, saat masih terus di identifikasi untuk mengetahui penyebabnya. Salah satu gejala yang ditimbulkan adalah timbulnya warna merah seperti karat pada bagian selaput gonad (bagian bawah cangkang). Kasus serangan penyakit pada kerang terjadi pada kerang abalone yang mengalami gejala ini, dalam waktu 5-6 hari lapisan selaput akan sobek, nampak lemas dan jika dipegang sangat lembek (tidak dapat merespon ransangan luar) yang akhirnya mengalami kematian. Tindakan pencegahan yang telah dilakukan saat ini adalah tindakan karantina atau pemisahan pada tempat khusus
sebelum selaput gonad sobek/terpisah dari
cangkang,kemudiandilakukan tindakan pengobatan dengan cara pengolesana criflavin atau betadine dalam dosis tinggi (500ppm) pada selaput tersebut secara kontinyu selama 3 hari. Tindakan ini juga dilakukan pada kerang abalone yang mengalami luka.
Gambar 6. Gejala kerang abalone yang sakit, nampak lemas (kiri), warna karat (kanan).
Beberapa penelitian menyebutkan bahwa ada beberapa jamur yang menyerang abalone diantaranya adalah Halipthorus milfordensis dari kelas Deutromycotina yang menyerang Haliotis sieboldii, H. iris, H. australis dan H. virginea (Bower, 2006). Di Yamaguchi juga telah diisolasi jamur Atkinsiellaawabi yang menyerang H. sieboldii
(Nakamura, 1994). Balai Besar Riset Penelitian Laut Gondol juga berhasil mengisolasi jamur Lagenidium sp. Yang menyerang Haliotis asinina pada skala hatchery. Hasil identifikasi menunjukkan hifa jamur berkembang menjadi vesikel, kemudian menjadi zoospora dan pecah sehingga spora berenang bebas untuk mencari inang baru. Jamur ini diisolasi pada abalone yang berumur sekitar 2 tahun. Ciri-ciri yang ditimbulkan dari serangan jamur ini adalah bintik putih pada tubuh ablone, dan pada abalone yang serangannya cukup serius muncul gejala seperti borok.
Jamur merupakan patogen yang penting pada moluska karena merupakan patogen yang ganas (menimbulkan kematian sampai 100%) pada stadia larva dan post larva dalam usaha pembenihan, merusak telur, secondary invander yang dapat merusak struktur cangkang, agen berbahaya bagi juvenil bahkan moluska dewasa baik yang di alam maupun di wadah budidaya (Irwansyah, 2006). Perkembangan serangan jamur terhadap moluska dapat dibedakan berdasarkan hal-hal berikut ini:
a) Serangan ringan biasanya ditunjukkan dengan adanya bintik putih tipis yang menonjol, semakin lama bintik-bintik tersebut akan menyatu dan bisa menutupi seluruh permukaan cangkang.
b) Serangan serius ditunjukkan dengan adanya tonjolan seperti karet berwarna hijau atau coklat dan cangkang bagian dalam yang menonjol.
Pemeriksaan gejala serangan penyakit juga dapat dilakukan dengan beberapa metode. Saat ini telah dikembangkan berbagai metode diagnosis virus diantaranya metode konvensional seperti histopatologi, dotblot, hibridisasi, in situ dan PCR dan RT-PCR. Metode diagnosis dengan PCR mungkin merupakan salah satu metode yang cepat dan menjanjikan tingkat akurasi yang tinggi dibandingkan metode lain. Sampel dapat disiapkan dalam awetan alkohol 70% dalam potongan kecil (0,5 cm), untuk PCR dan penggunaan formalin 10% untuk pemeriksaan histopatologi (Nguyen, 1997).
Metode PCR merupakan metode untuk memperbanyak molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Sulandari, 2003). Dengan metode ini dapat diperoleh pelipatgandaan suatu sekuen DNA dalam genom virus yang mana hanya dengan mencampurkan kulturnya di dalam tabung PCR. Sehingga dari jaringan tubuh kerang yang sakit dapat diketahui jenis organisme patogen yang menyerangnya.
Otak ikan dan jaringan lain hewan invertebrate telah diuji dengan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dengan tujuan untuk mendeteksi betanodavirus. Hasil positif uji PCR diperoleh dari otak 8 jenis ikan laut (shrimp fish Aeoliscus strigatus, milkfish
Chanos chanos, three spot damsel Dascyllus trimaculatus, Japanese anchovy Engraulis japonicus, pinecone fish Monocentris japonica, blue ribbon eel Rhinomuraena quaesita, look down fish Selene vomer, yellow
tang Zebrasoma flavesenes), 1 jenis invertebrate laut (spiny lobster
Pamulirus versicolor), dan 2 jenis kerang air tawar (South American leaf fish Monocirrhus polyacanthus and red piranha Pygocentrus nattereri). Tingkat pendeteksian PCR adalah 11/237 (4.64%). Secara subklinik dan ikan dalam akuarium terkena infeksi dan invertebrate berdasarkan sumber inoculum betanodaviruses. Betanodaviruses adalah agen peyebab serangan viral nerveus necrosis (VNN) pada budidaya ikan laut.
Beberapa sistem diagnosa yang efektif dari VNN antara lain:
a) Berdasarkan Asam Nukleat misalnya RT-PCR dan PCR serta Hibridisasi secara in situ.
b) Berdasarkan Protein misalnya IFA, penandaan IHC, ELISA, Western Blot dan One-step Immunochromatography.
c) Berdasarkan Virion misalnya Kultur Sel.
Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik. Pada awal perkembangannya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah cara in vitro untuk memperbanyak target sekuen spesifik AN untuk analisis cepat atau karakterisasi, walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat sedikit. Pada dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu: denaturisasi, hibridisasi dari "primer" sekuen DNA pada bagian
tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan (Prijanto, 1992).
a) Prinsip Kerja PCR
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas (950C) selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 550C sehingga primer akan menempel annealing pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplomenter dengan sekuen primer. Suhu 550C yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah (370C) tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Pada suhu yang lebih tinggi (550C) spesifisitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan efisiensinya akan menurun. Reaksi ini dilakukan berulang-ulang sampai 25-30 kali (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan jumlah DNA cetakan yang digunakan.
b) Komponen PCR
Ada 2 komponen terpenting dari reaksi PCR, yaitu sekuen DNA pendek atau sisi area yang akan dikopi. Tindakan utama adalah untuk mengidentifikasi atau menentukan target dari cetakan DNA
yang akan dikopi. Yang mengendalkerang reaksi PCR adalah oligonukleotida yang diciptakan secara kimiawi dan ditambahkan dalam konsetrasi yang tinggi ke dalam cetakan DNA. Beberapa pengetahuan tentang rangkaian DNA yang tercetak dibutuhkan untuk rangkaian primer yang sesuai. Komponen lain dari reaksi PCR terdiri dari kerangka DNA yang akan dicetak, membangun blok dengan membentuk ke empat nukleutida, dan DNA polimerase bergabung dengan blok pada dasar dari rangkaian kerangka DNA. Ketika menset sample yang berisi beberapa primer dan reaksi komponen, ini biasa untuk mempersiapkan campuran sempurna yang dapat memberikan kuantitas sama pada PCR lain. Prosedur ini membantu untuk memastikan adanya homogenitas di antara sampel-sampel. Dalam melakukan percobaan terhadap sampel yang berbeda-beda, utamanya harus memeriksa variasi dari sampel DNA dengan tidak ada perbedaan pada reaksi komponen dan cara pengolahan sampel.
Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim DNA polymerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer.
Sampel yang didapatkan akan diekstraksi untuk mendapatkan materi genetiknya (RNA). Ekstraksi ini diawali dengan penambahan 500 µl RNA extraction solution. Pemberian RNA extraction solution dikarenakan VNN termasuk dalam golongan virus RNA. Kemudian larutan tersebut digerus dengan pellet pestle steril dan diinkubasi
pada suhu (25-300C) selama 5 menit setelah itu diberi 100 µl chloroform dan di vortex kembali. Inkubasi ini bertujuan untuk mengkondisikan lingkungan untuk tumbuh dan berkembang biak sehingga virus dapat tumbuh dan menunjukan karakteristik sesuai dengan yang dikehendaki, sedangkan pemberian chloroform dapat membantu menghilangkan penghambat PCR yang terdapat pada larutan ekstrak metode ini akan menghasilkan lapisan air yang mengandung asam nukleat.
Sampel kemudian diinkubasi kembali dalam suhu 25-300C selama 2- 3 menit selanjutnya di sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Sentifugasi bertujuan untuk memisahkan berat jenis larutan sehingga nantinya dapat dipisahkan dimana berat jenis yang lebih kecil akan naik ke atas. Setelah di sentrifugasi fase cair yang ada dibagian atas dipindahkan sebanyak 200 µl ke dalam mikrotube dengan ditambahkan 200 µl isopropanol dan divortex (dicampur) selama 20 detik. Sentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit kemudian buang cairan pada bagian atas. Hasil akhirnya kemudian dicuci dengan alkohol 75 % sebanyak 500 µl dan disentrifugasi kembali pada kecepatan 9000 rpm selama 5 menit. Kemudian buang alkohol absolute dan keringkan. Padatan yang ada kemudian dilarutkan dengan 200 µl ddH2O (aquabides). c) Amplifikasi
Amplifikasi merupakan reaksi pelipatgandaan cDNA target secara in vitro sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis (Anonim, 2011). Sebelum dilakukannya amplifikasi terlebih dahulu disiapkan formulasi reaksi first PCR dan nested PCR untuk sejumlah reaksi yang mana terdiri dari 1 kontrol positif berat, 1 kontrol positif sedang atau 1 kontrol positif ringan, 1 kontrol negatife dan sejumlah
sampel. Komposisi pereaksi untuk first PCR dan nested PCR tercantum dalam tabel dibawah ini.
Tabel 2. Komposisi pereaksi untuk first PCR (RT-PCR reaction) No. Pereaksi Jumlah atau Volume Pereaksi 1. Premix RT-PCR 7 µl
2. IQzyme 2 unit/µl 0.5 µl 3. RT-enzyme mix 0.5 µl
Tabel 3. Komposisi pereaksi untuk nested PCR
No. Pereaksi Jumlah atau Volume Pereaksi 1. Premix nested PCR 14 µl
2. IQzyme 2 unit/ µl 1 µl
Formulasi reaksi yang dibuat kemudian ditambahkan ke dalam sampel dimana 2 µl sampel ditambahkan 8 µl pereaksi first PCR dalam mikrotube ukuran 0.2 ml. Proses ini juga dilakukan pada kontrol positif dan negatife kemudian dilakukan proses amplifikasi dengan siklus seperti tabel di bawah ini.
Tabel 4. Pengaturan suhu dan siklus Thermocycler reaksi first PCR.
No. Suhu Lama Jumlah Siklus
1. 420C 30 menit 1 siklus 2. 940C 2 menit 3. 940C 30 detik 15 siklus 4. 620C 30 detik 5. 720C 30 detik 6. 720C 30 detik 1 siklus 7. 200C 7 menit
Setelah reaksi first PCR selesai ke dalam setiap mikrotube ditambahkan 15 µl pereaksi nested PCR dan dilanjutkan dengan amplifikasi dengan siklus pada tabel 4 berikuti ini.
Tabel 5. Pengaturan suhu dan siklus Thermocycler reaksi nested