DAFTAR PUSTAKA
MENGGUNAKAN BUFFER EKSTRAKSI CTAB DAN PCR Dirvamena Boer
I. PROSEDUR ISOLASI DNA JATI
A. Prosedur Ekstraksi DNA Buffer ekstrasi:
100 mM Tris.HCl pH 8.0 (10 ml dari 1 M Tris.HCl, pH 8.0) 40 mM EDTA (8 ml dari 0.5 M EDTA.NaOH, pH 8.0) 1.4 M NaCl
0.5% ß-mecraptoethanol 2% CTAB (2g/100 ml) 1% PVPP atau arang aktif pH 7.9 – 8.1
Prosedur Ekstraksi
1. Penghancuran jaringan tanaman secara fisik dan kimiawi
• Daun jati digerus dalam nitrogen cair pada mortar (optional daun jati digerus dalam larutan buffer CTAB)
• Ditambahkan 1% PVPP untuk menghambat aktifitas polyphenoloxidase (Rogers dan Bendich, 1988), kemudian digerus kembali sampai halus (optional arang aktif dapat juga digunakan untuk menjerap senyawa fenolik)
• Serbuk halus yang dihasilkan dimasukan ke dalam tabung eppendorf • Ditambahkan 500 µl buffer ekstraksi (2% CTAB buffer), yang sebelumnya
telah dipanaskan pada suhu 65oC dan diberi 0.5% ß-mecraptoethanol yang ditambahkan saat melakukan ekstrasi kemudian digoyang-goyang supaya tercampur sempurna selama beberapa detik
• Optional: Tambahkan 2 µl (100 mg/ml) RNAse untuk menghilangkan molekul RNA (atau ditambahkan saat pemurnian dengan fenol)
• Inkubasi pada suhu 65oC selama 20 menit dan dibulak-balik perlahan secara regular supaya buffer tercampur dengan sempurna dengan sampel 2. Menghilangkan debris serta pemurnian dari komponen selain DNA
• Samplel DNA diletakan segera pada es selama 2 menit
• Ditambahkan 350 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1 pH dibuat 8.0) kemudian dikocok atau diletakkan pada shaker selama 10 menit
• Campuran kemudian disentrifusi pada 14000 g selama 8 menit pada suhu ruang
• Cairan bagian atas dipindahkan (± 450 µl) dengan cara memipet ke dalam tabung yang baru dan ditambah 250 µl chloroform, kemudian dicampur dengan cara mengocok atau diletakkan pada shaker selama 5 menit
3. Persipitasi DNA (pemekatan konsentrasi) dengan ethanol
• Cairan bagian atas dipindahkan (± 420 µl) dengan cara memipet ke dalam tabung lain kemudian DNA diendapkan dengan menambahkan 2 kali dari total volume ethanol 100% dingin dibolak balik secara perlahan sampai terlihat benang-benang DNA yang halus berwarna putih
• Inkubasi pada suhu dingin (dalam freezer) selama 10 menit • Sentrifusi pada 5000 g selama 4 menit
• Supernatan dibuang dan tabung diseka hingga kering dengan kertas tissue • Pellet dilarutkan dalam 200 µl TE (10:2) lalu diaduk dengan ujung pipet
tip, pencampuran dilakukan secara hati-hati dengan ujung pipet kemudian ditambahkan 1/10 Sodium Asetat
• Inkubasi 15 menit pada suhu kamar
• Kemudian DNA dicuci dengan 500 µl 70% ethanol dengan cara mengocok selama setengah jam sampai beberapa jam dan disentrifusi pada 5000 g selama 4 menit
• Kemudian bagian cairan dibuang dan tabung dikeringkan menggunakan kertas tissue
• Pellet yang diperoleh segera dikeringkan secara sempurna diletakan pada blok pemanas 40oC beberapa menit
• DNA dilarutkan dalam 104 µl TE (10:1), lalu diletakkan pada shaker untuk beberapa jam (semalam) kemudian sentrifugasi pada 12000 g selama 4 menit
• Cairan sebanyak 100 µl yang mengandung DNA dipindahkan ke dalam tabung mikro baru
Pemurnian DNA dengan Phenol
1. Setelah pelet DNA diperoleh, DNA dilarutkan dalam 300 µl TE
2. Ditambahkan RNAse sebanyak 3 µl (1 mg/ml, inkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit)
3. Ditambahkan fenol kloroform (dari kulkas) 1 volume, dikocok kemudian disentrifuse selama 15 menit pada 11000 rpm.
4. Bagian atas (atas bening, bawah putih) diambil dan dipindahkan ke tube lain. 5. Ditambahkan CIA 1 volume lalu dikocok perlahan, kemudian disentrifuse
selama 5 menit pada 11000 rpm
6. Cairan bagian atas diambil dan dipindahkan ke tube lain
7. Diambahkan 10 µl Na-asetat 3 M pH 5.2 dan 600 µl isopropanol dingin, dikocok dan diinkubasi di lemari es selama 30 menit, kemudian disentrifuse 8. Cairan dibuang, pellet DNA yang terbentuk lalu ditambahkan ethanol 70-80%
sebanyak 100-200 µl
9. Disentrifuse selama 2-5 menit, cairan dibuang, DNA terbentuk.
10. Tube ditaruh di atas tissue secara terbalik (semalam atau 1 jam di vacum) 11. Ditambahkan air bebas ion 100 ul atau buffer TE
100 B. Penetapan Kualitas dan Kuantitas DNA
Uji Kuantitas
1. Sebanyak 50 µl larutan stok DNA diencerkan menjadi 4 ml dengan menambahkan aquades
2. Sebagai blangko digunakan aquades
3. Absorban diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
4. Pembacaan pada A=1 berarti konsentrasi DNA adalah 50 µg/ml dan dianggap sebagai faktor konversi
5. Kemurnian DNA ditentukan dari nilai perbandingan A260/A280. Nilai ratio kemurnian adalah 1.8 – 2.0
6. Konsentrasi DNA dihitung dengan rumus:
260
( / ) * *
DNA µg ml = faktor konversi faktor pengenceran A Uji Kualitas (Elektroforesis pada Gel Agarose)
1. Setelah gel agarose ditempatkan dalam chamber elektroforesis, kemudian diisi dengan buffer TAE 1 X hingga gel terendam setinggi 1 – 2 mm
2. Sampel DNA (5 µl DNA, 2 µl loading dye) dimasukan ke dalam sumur pada gel
3. Alat elektroforesis kemudian disambungkan ke power supply yang telah diset 60 volt selama 1 jam atau 100 vol selama 30 menit
4. Gel yang telah dielektroforesis diletakan di atas UV transluminator, DNA yang mengikat EtBr akan berpendar di bawah sinarUV, kemudian difoto II. POLIMERASE CHAIN REACTION
A. Profil untuk PCR
1. Sample DNA dimasukan sebagai cetakan 2 ul (10-100 ng) langsung ke dasar tabung PCR
2. Dibuat campuran (premix) dalam tabung 1.5 ml sebagai berikut: Premix PCR untuk satu reaksi
Reangen Produk NBE Produk Promega
ddH2O Buffer MgCl2 dNTP mix Primer F Primer R Taq 5.9 µl 2.5 µl - 0.5 µl 7 µl 7 µl 0.1 µl 3.4 µl 2.5 µl 2.5 µl 0.5 µl 7 µl 7 µl 0.1 µl Total 23 µl 23 µl
3. Kemudian divortex (vortex mixer briefly) dan spin down briefly. Pemindahan tabung dari rak ke mesin vortex mixer dan sentrifuse harus dilakukan berurutan sesuai nomor sample
4. Tabung PCR disusun dalam blok pemanas mesin thermal cycler.
5. Mesin thermal cycler kemudian dijalankan dengan program yang disesuaikan dengan primer, profil PCR yang digunakan sebagai berikut:
Profil PCR yang digunakan
Proses Suhu Waktu
Pre-PCR 94 oC 5 menit
Denaturasi 94 oC 40 detik Anneling 52 oC 1 menit
Elongation 72 oC 2 menit 35 siklus Post-PCR
Penyimpanan 72 oC
4 oC sampai mesin dimatikan 7 menit
III. PROSEDUR PEMBUATAN LARUTAN
A. Larutan CTAB 5% (larutan stok, 100 ml) Komposisi Bahan:
CTAB : 5.0 g NaCl : 2.05 g Aquades steril : 100 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Larutan stok yang terbentuk kemudian disimpan dalam botol bening bertutup (100 ml) dan disimpan pada suhu ruang.
B. Buffer Tris-HCl 1 M pH 8.0 (larutan stok, 100 ml) Komposisi Bahan:
Tris base : 12.11 g HCl p.a : ± 4.2 ml Aquades steril : 80 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Atur pH larutan hingga 8.0 dengan menambahkan HCl pekat, kemudian ditera dengan aquades steril hingga 100 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml) kemudian disterilisasi dengan autoclave. Simpan larutan stok pada suhu ruang.
102 C. Larutan EDTA 0.5 M pH 8.0 (larutan stok, 100 ml)
Komposisi Bahan:
EDTA : 18.61 g NaOH : 2.0 g Aquqdes steril : 80 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Atur pH larutan hingga 8.0 dengan menambahkan NaOH 2.5 M, kemudian ditera dengan aquades steril hingga 100 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml) kemudian disterilisasi dengan autoclave. Simpan larutan stok pada suhu ruang.
D. NACl 5 M (larutan stok, 100 ml) Komposisi Bahan:
NaCl : 29.22 g Aquades steril : 65 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Volume kemudian ditera dengan aquades steril hingga 100 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml) kemudian disterilisasi dengan autoclave. Simpan larutan stok pada suhu ruang.
E. Buffer Tris-HCl 1 M pH 7.4 (larutan stok, 50 ml) Komposisi Bahan:
Tris base : 6.055 g HCl p.a : ± 3.5 ml Aquades steril : 35 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 100 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Atur pH larutan hingga 7.4 dengan menambahkan HCl pekat, kemudian ditera dengan aquades steril hingga 50 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml) kemudian disterilisasi dengan autoclave. Simpan larutan stok pada suhu ruang.
F. Na-Asetat 3 M pH 5.2 (larutan stok, 100 ml) Komposisi Bahan:
Na-Asetat.3H2O : 40.81 g Asam asetat glacial : ± ?? ml Aquades steril : 55 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Atur pH larutan hingga 5.2 dengan menambahkan Asam asetat glacial, kemudian ditera dengan aquades steril hingga 100 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml) kemudian disterilisasi dengan autoclave. Simpan larutan stok pada suhu ruang.
G. Buffer TE (Tris-HCl : EDTA) 50X (larutan stok, 50 ml) Komposisi Bahan:
Tris-HCl 1 M pH 8.0 : 25 ml EDTA 0.5 M pH 8.0 : 5 ml Aquades steril : 20 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 100 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Larutan disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring kuantitatif sebelum dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml). Simpan larutan stok pada suhu ruang.
H. Buffer TAE 50X (larutan stok, 100 ml) Komposisi Bahan:
Tris base : 24.2 g Asam asetat glacial : 5.7 ml EDTA 0.5 M pH 8.0 : 10 ml Aquades steril : 50 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Volume kemudian ditera dengan aquades steril hingga 100 ml. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml). Simpan larutan stok pada suhu ruang.
104 I. Buffer Ekstraksi, CTAB 2% (larutan kerja, 100 ml)
Komposisi Bahan: CTAB 5% : 40 ml NaCl 5 M : 25.2 ml EDTA 0.5 M pH 8.0 : 4 ml Tris-HCl 1 M pH 8.0 : 10 ml Aquades steril : 20.8 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dilarutkan di dalam beaker glass 250 ml menggunakan magnetic strirrer pada hot plate. Larutan dimasukan ke dalam botol bening bertutup (100 ml). Simpan larutan kerja pada suhu ruang.
J. ß-mecraptoethanol (larutan kerja, 50 ml) Komposisi Bahan:
ß-mecraptoethanol : 50 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml), kemudian larutan kerja tersebut disimpan pada suhu kamar.
K. KIA 24:1 (Kloroform : Isoamil alkohol) (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Kloroform : 96 ml Isoamil alkohol : 4 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml). Pencampuran dilakukan dengan menggoncang botol, kemudian larutan kerja tersebut disimpan pada suhu ruang.
L. Isopropanol dingin (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Isopropanol : 100 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml), kemudian larutan kerja tersebut disimpan dalam lemari pendingin, 4oC.
M. Ethanol absolut dingin (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Ethanol p.a. (100%) : 100 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml), kemudian larutan kerja tersebut disimpan dalam lemari pendingin, 4oC.
N. Ethanol 70% (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Ethanol p.a. (100%) : 70 ml Aquades steril : 30 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml). Pencampuran dilakukan dengan menggoncang botol, kemudian larutan kerja tersebut disimpan dalam lemari pendingin, 4oC.
O. RNAse-A (cat. no. R-5125) (10 mg/ml) Komposisi Bahan:
RNAse-A : 10 mg Na-Asetat 3 M pH 5.2 : 3.3 µl Aquades steril : 996.7 µl Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan ke dalam tabung mikro 2 ml, pencampuran dilakukan dengan spin manual. Suspensi diinkubasi dengan waterbath pada suhu 100oC selama 15 menit, kemudian dibiarkan pada suhu ruang, setelah itu ditambah 100 µl (0.1 volume) Tris-HCl 1 M pH 7.4. Simpan dalam freezer, -20oC.
P. Buffer TE (Tris-HCl : EDTA) 1X (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Buffer TE 50X : 2 ml Aquades steril : 98 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (100 ml). Pencampuran dilakukan dengan menggoncang botol, kemudian larutan kerja tersebut disimpan pada suhu ruang.
106 Q. Loading Buffer (larutan kerja, 50 ml)
Komposisi Bahan:
Bromophenol blue : 1.25 gram Sukrosa : 20 gram Xylol : 50 µl Cara membuat:
Larutkan bromophenol blue dalam 10 ml aquades, demikian juga dengan sukrosa. Kemudian campurkan kedua larutan tersebut ke dalam botol bening dan tambahkan xylol kemudian ditera menjadi 50 ml, pencampuran dilakukan dengan spin manual. Simpan dalam suhu kamar dalam bentuk eliquat.
R. Buffer TAE 1X (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan:
Buffer TAE 50X : 20 ml Aquades steril : 980 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan dalam botol bening bertutup (1000 ml). Pencampuran dilakukan dengan menggoncang botol, kemudian larutan kerja tersebut disimpan pada suhu ruang.
S. Ethidium bromide 0.05% (larutan kerja, 100 ml) Komposisi Bahan: (Hati-hati karsinogenik)
Ethidium bromida : 5 g (botol kemasan 5 g) Cara membuat:
Buat larutan stock dengan cara menambahkan 10 ml aquades ke dalam botol bahan ethidium bromide (konsentrasi menjadi 50%) kocok sampai tercampur. Pipet 100 µl stock 50% Ethidium tersebut dan masukan ke dalam kotak yang berisi aquades sebanyak 100 ml (larutan kerja 0.05%). Bahan tersebut disimpan ditempat yang terlindung dari cahaya (kondisi gelap), dan diletakan pada suhu ruang ditempat yang aman (berbahaya).
T. Agarose 0.8% (elektroforesis) Komposisi Bahan:
Agarose : 0.32 g TAE 1X : 40 ml Cara membuat:
Bahan tersebut dimasukan ke dalam beaker glass 100 ml, lalu dipanaskan menggunakan hot plate, sekali-kali dikocok dengan cara menggoyangkan beaker glass sampai semua agar larut. Pada saat mendidih, hentikan pemanasan kemudian dinginkan pada suhu kamar. Kira-kira suhu sudah turun menjadi + 65oC (beaker glass sudah tidak terlalu panas untuk dipegang), tuangkan gel ke dalam pencetak gel, kemudian pasang sisir 0.5-1 mm dari dasar cetakan gel lalu dibiarkan memadat (kurang lebih 1 jam). Gel siap digunakan untuk elektroforesis atau dapat disimpan dalam lemari pendingin, 4oC.
U. Larutan Fenol Komposisi Bahan: Kristal Fenol : 250 g β-hydroxyquinolin : 1% Tris-HCl 1 M pH 8.0 : 1 volume Cara membuat:
Panaskan kristal fenol pada hotplate dengan suhu 68oC sampai berubah menjadi fase larutan (+ 250 gram kristal fenol ≈ 200 ml larutan), kemudian tambahkan 0.1% hydroxyquinolin. Untuk mengatur pH fenol tambahkan buffer Tris-HCl dengan voleme sama lalu kocok dengan stirer selama 15 menit dengan kecepatan tinggi biarkan sampai terpisah, lalu buang fase Tris-HCl, lakukan penambahan buffer Tris HCl dan stirer sampai tiga kali lalu ukur pH fenol (diperkirakan sekitar 7.8). Ke dalam larutan fenol tersebut tambahkan 0.2% β-mecraptoethanol, untuk menghindari terjadinya oksidasi tambahkan 10% volume 0.1 M Tris-HCl (ada dua fase yaitu bagian bawah fenol yang berwarna kuning dan fase atas Tris HCl). Simpan dibotol gelap pada suhu 4oC.
108 Lampiran 9. Prosedur elektroforesis polyacrylamide