MUFIDA ELFA WINDAYU Aktivitas Antimikroba Kulit Batang Kayu Api-api Betina (Avicennia marina) terhadap Bakteri dan Fungi Patogen secara In Vitro.
2 TINJAUAN PUSTAKA
3.4 Metode Analisis 1 Rendemen ekstrak
Sampel (kulit batang) api-api diambil dari kawasan mangrove Pantai Indah Kapuk, Jakarta. Kulit batang diambil dengan menyayat batang pohon hingga batas kambium. Sampel kulit batang api-api dibawa dengan plastik ber-sealer, agar terhindar dari udara luar. Sampel tersebut kemudian dicuci untuk menghilangkan kotoran yang menempel dan dijemur di bawah sinar matahari sampai kadar airnya dibawah 10%. Bagian yang sudah dikeringkan, dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk dan ditimbang sebanyak 50 gram.
Sampel serbuk kulit batang api-api selanjutnya diekstraksi dengan cara maserasi partisi dan maserasi bertingkat. Perbandingan antara sampel dan masing-masing pelarut adalah 1: 3 (b/v). Maserasi partisi dilakukan dengan merendam sampel dalam pelarut metanol selama 24 jam, tujuannya untuk menarik semua komponen bioaktif pada kulit batang api-api. Hasil maserasi disaring, kemudian filtrat dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 50 °C. Ekstrak metanol pekat dipartisi dengan n-heksan menggunakan corong pemisah. Fase n-heksan dipekatkan dan didapatkan ekstrak n-heksan. Ekstrak metanol, setelah dipartisi dengan n-heksan dipartisi kembali dengan etil asetat. Fase etil
asetat dipekatkan dan didapatkan ekstrak etil asetat. Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan didapatkan ekstrak metanol. Hasil ekstrak yang diperoleh dalam bentuk pasta. Diagram alir proses ekstraksi komponen bioaktif kulit batang api-api secara maserasi partisi disajikan pada Lampiran 1.
Maserasi bertingkat dilakukan dengan cara merendam sampel dalam pelarut n-heksan selama waktu maserasi 24 jam. Hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring hingga diperoleh residu dan filtrat yang diinginkan. Residu sisa ekstraksi n-heksan dimaserasi kembali menggunakan etil asetat selama 24 jam, sedangkan filtratnya dievaporasi hingga didapatkan pelarut dan ekstrak yang terpisah (ekstrak n-heksan). Hasil maserasi etil asetat kemudian disaring, residu yang dihasilkan dilarutkan dengan metanol dan dimaserasi selama 24 jam, sedangkan filtratnya dievaporasi hingga didapatkan pelarut dan ekstrak etil asetat. Hasil maserasi metanol kemudian disaring dan filtratnya dievaporasi (ekstrak metanol). Hasil ekstrak yang diperoleh dalam bentuk pasta. Diagram alir proses ekstraksi komponen bioaktif kulit batang api-api secara maserasi bertingkat disajikan pada Lampiran 2.
Masing-masing ekstrak yang diperoleh, baik hasil maserasi partisi maupun maserasi bertingkat, ditimbang beratnya. Persentase rendemen ekstrak kulit batang api-api dapat dihitung dengan rumus:
3.4.2 Uji aktivitas antimikroba (modifikasi Coyle 2005)
Uji ini meliputi persiapan media cair, persiapan media padat dan prosedur aktivitas antibakteri. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur agar (Kirby Bauer).
a. Persiapan media cair
Bakteri uji yaitu Escherichia coli dan Staphylococcus aureus disegarkan terlebih dahulu menggunakan media nutrient broth (NB), sedangkan untuk golongan khamir yaitu Candida albicans dan Microsporum gypseum disegarkan menggunakan media potato dextrose broth (PDB). Nutrient Broth dan Potato Dextrose Broth (Oxoid) dilarutkan dalam akuades, media tersebut dihomogenkan menggunakan
hotplate pada suhu 100 °C. Media yang telah homogen dimasukkan sebanyak 20 mL ke dalam tabung reaksi dan ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Media tersebut disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang.
b. Persiapan media padat
Media padat yang digunakan adalah Mueller Hinton agar (MHA) dan Potato Dextrose Agar (PDA). Bubuk MHA dan PDA (Oxoid) dilarutkan dalam akuades, lalu dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100 °C. Larutan kemudian dipipet 20 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Media tersebut disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Media didiamkan di laminar aseptik sampai agar beku. Apabila media sudah beku, media disimpan dalam refrigerator. c. Persiapan suspensi mikroba
Sebanyak satu ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair nutrient broth (NB) yang telah dingin secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 18-24 jam. Biakan bakteri yang telah diinkubasi, diukur rapat optis atau optical density (OD) nya dengan nilai antara 0,5-0,8 pada panjang gelombang 600 nm. Fungi yang telah disegarkan sebelumnya diambil satu ose dan dimasukkan ke dalam media cair potato dextrose broth (PDB) secara aseptik. Media berisi mikroba uji tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 18-24 jam.
d. Pengujian antibakteri
Tahap pertama pada uji aktivitas antimikroba yaitu sebanyak 20 mL media MHA dalam keadaan cair ditambahkan 20 µL bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus menggunakan pipet mikro, sedangkan untuk Candida albicans dan Microsporum gypseum menggunakan media PDA. Media agar yang telah ditambahkan bakteri uji dihomogenkan dengan vortex, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar bakteri lebih menyebar dan media MHA tercampur merata. Media agar terebut
didiamkan dalam clean bench aseptik selama 15 menit atau sampai agar beku. Pada pengujian antifungi Microsporum gypseum, media PDA sebanyak 20 mL dalam keadaan cair dituang ke cawan petri dan didiamkan dalam clean bench aseptik hingga agar beku. Microsporum gypseum diteteskan sebanyak 20 µL dan disebar ke seluruh permukaan agar menggunakan hockey stick.
Apabila media MHA dan PDA tersebut telah membeku, dibuat sumur berdiameter 6 mm menggunakan pangkal pipet pasteur. Tiap sumur
ditambahkan ekstrak sejumlah 2 mg/sumur, 1 mg/sumur dan 0,5 mg/sumur. Cawan disimpan dalam refrigerator selama 3 jam supaya
ekstrak berdifusi dengan agar. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 18-20 jam dengan suhu 37 °C untuk bakteri dan suhu ruang untuk fungi. Aktivitas antimikroba dapat dilihat dengan mengamati zona hambatan yang terbentuk di sekeliling sumur. Antimikroba dikatakan positif jika terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling sumur dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur lebarnya menggunakan penggaris. Data aktivitas antimikroba berupa rataan diameter zona bening disajikan dalam statistik deskriptif.
3.4.3 Uji Minimum Inhibitory Concentration (Mazzola et al. 2009)
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dilakukan untuk mengetahui konsentrasi minimum dari ekstrak yang terpilih dalam menghambat aktivitas pertumbuhan dari bakteri uji. Beberapa tahapan dalam proses MIC, yaitu prekultur dan perhitungan MIC.
a. Prekultur bakteri uji
Prekultur dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri uji sebanyak 1 ose dan dimasukkan dalam media NB dan biakan fungi dalam media PDB, kemudian diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37 °C untuk bakteri dan suhu ruang untuk fungi.
b. Perhitungan MIC
Ekstrak kulit batang tumbuhan api-api yang mempunyai aktivitas penghambatan yang terbaik dilanjutkan dengan penentuan MIC. Metode
yang digunakan adalah metode dilusi cair (Broth Dilution). Media cair untuk bakteri menggunakan media NB dan untuk fungi menggunakan media PDB. Tabung reaksi disiapkan sejumlah 9 buah dan diberi nomor sesuai urutan. Setiap tabung diisi 3 mL media cair. Tabung ke-1 hingga ke-8 secara berurutan ditambahkan ekstrak antimikroba terpilih dengan konsentrasi 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL, 1 mg/mL, 1,5 mg/mL dan 2 mg/mL.
Tabung 1 hingga 9 ditambah 3 µL suspensi mikroba. Tabung 9 digunakan sebagai kontrol positif sehingga tidak ditambah dengan ekstrak antimikroba. Tabung diinkubasi pada suhu 37 °C untuk bakteri dan pada suhu 30 °C untuk fungi selama 18-24 jam. Pertumbuhan mikroba diamati dengan adanya kekeruhan pada media. Penentuan MIC dilakukan dengan melihat konsentrasi ekstrak terendah yang masih menunjukkan penghambatan, ditandai dengan nomor tabung terkecil yang masih jernih. 3.4.4 Uji fitokimia (Harborne 1987)
Uji fitokimia bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak kulit batang api-api (Avicennia marina). Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan tanin.
a. Alkaloid
Sebanyak 1 g sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, Meyer dan Wagner. Hasil uji dinyatakan positif apabila pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan cokelat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah sampai jingga dengan pereaksi Dragendorff.
b. Steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 g sampel dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung reaksi yang kering, lalu kedalamnya ditambahkan 10 tetes anhidrat asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
c. Flavonoid
Sebanyak 1 g sampel ditambah 0,1 mg bubuk magnesium dan 0,4 mL amil alkohol (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan ditambah 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
d. Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N menunjukkan adanya senyawa saponin.
e. Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 mL etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Adanya senyawa fenol dalam bahan ditandai dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru.
f. Tanin
Sebanyak 1 g sampel ditambahkan pereaksi FeCl3. Adanya komponen tanin ditandai dengan terbentuknya warna merah tua.
3.4.5 Uji kandungan total fenol (Ramamoorthy dan Bono 2007)
Uji kandungan total fenol dilakukan untuk mengetahui jumlah fenol yang terdapat pada sampel. Ekstrak kasar yang memiliki aktivitas antibakteri terbaik, ditimbang sebanyak 5 mg lalu dilarutkan dengan 2 mL etanol 95%. Larutan ditambahkan 5 mL akuades dan 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Campuran didiamkan selama 5 menit dan ditambahkan 1 mL Na2CO3 5% (b/v). Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi dalam kondisi gelap selama satu jam. Serapan yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer UV-Visible pada pannjang gelombang 725 nm. Asam galat digunakan sebagai standar dengan konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25, dan 50 mg/L. Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai miligram ekivalen asam galat (GAE= Galic Acid Equivalen) per 1000 gram sampel (mg GAE/1000 g sampel).
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Rendemen Ekstrak Kulit Batang Api-api
Senyawa bioaktif dari kulit batang api-api didapatkan dengan proses ekstraksi. Proses ekstraksi senyawa antibakteri dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu aqueous phase dan organic phase. Ekstraksi aqueous phase dilakukan dengan pelarut air, sedangkan ekstraksi organic phase menggunakan pelarut organik. Prinsip kelarutan yaitu polar melarutkan senyawa polar, pelarut semi polar melarutkan senyawa semi polar, dan pelarut non polar melarutkan senyawa non polar (Harborne 1987).
Preparasi dari sampel segar menjadi sampel serbuk dimulai dengan sortasi untuk menghilangkan kotoran seperti tanah atau debu. Proses selanjutnya dilakukan pengeringan yang bertujuan menurunkan kadar air hingga kurang dari 10% sehingga tidak mudah busuk saat disimpan dan ekstraksi. Sampel kering kemudian dihaluskan menjadi serbuk. Hal ini dilakukan untuk memperluas permukaan kontak sampel dengan pelarut agar proses ekstraksi lebih efektif.
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu merendam sampel dalam pelarut dengan perbandingan sampel kulit batang api-api dan volume pelarut yaitu 1:3 (b/v). Menurut Ubulom et al. (2011) maserasi dilaporkan menghasilkan rendemen yang kecil dibandingkan metode ekstraksi yang lain, namun metode maserasi tidak membutuhkan pemanasan. Berdasarkan hal tersebut pemilihan maserasi sebagai metode ekstraksi dapat mencegah kerusakan senyawa yang kurang tahan panas pada penelitian ini. Pelarut yang digunakan terdiri dari tiga jenis yaitu metanol untuk mewakili pelarut polar, etil asetat untuk pelarut semi polar dan n-heksan sebagai pelarut non polar. Penggunaan ketiga pelarut ini bertujuan untuk mengekstrak komponen bioaktif dalam kulit batang api-api sesuai dengan tingkat kepolarannya sehingga zat aktif dapat diekstrak secara optimal pada salah satu pelarut yang digunakan.
Proses maserasi dilakukan dengan modifikasi menjadi dua cara yaitu maserasi partisi dan maserasi bertingkat. Maserasi partisi meliputi ekstraksi padat-cair dan ekstraksi cair-cair. Proses ekstraksi tersebut dilakukan dengan metode maserasi (ekstraksi padat-cair) yang dilanjutkan dengan partisi cair-cair.
Pada proses partisi cair-cair akan terbentuk dua fase karena perbedaan kelarutan. Ekstrak dari ketiga jenis pelarut tersebut menghasilkan karakteristik yang berbeda. Ekstrak metanol berwarna hijau kehitaman dengan tekstur cukup halus, berbeda dengan ekstrak n-heksan yang bertekstur kasar. Ekstrak etil asetat berwarna cokelat dan menggumpal. Hasil ekstraksi maserasi tersebut dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Ekstrak hasil maserasi partisi
Maserasi bertingkat dilakukan dengan ekstraksi padat-cair. Maserasi dilakukan secara bertahap dengan pelarut n-heksan, kemudian etil asetat dan terakhir metanol. Hal ini dilakukan untuk langsung memisahkan senyawa non polar dan semi polar terlebih dahulu. Umumnya pelarut metanol dapat melarutkan sebagian senyawa non polar dan semi polar. Hasil ekstraksi maserasi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7 Ekstrak hasil maserasi bertingkat
Ekstrak dari hasil maserasi bertingkat memiliki karakteristik yang berbeda dengan ekstrak hasil maserasi partisi. Esktrak metanol pada maserasi bertingkat
menghasilkan warna kuning kehitaman, ekstrak etil asetat berwarna hijau sedangkan ekstrak n-heksan berwarna kuning dan lengket.
Gambar 8 Rendemen ekstrak kasar kulit batang api-api metanol etil asetat n-heksan
Rendemen ekstrak kulit batang api-api yang diekstraksi dengan metanol menunjukkan jumlah yang paling tinggi, dari kedua metode maserasi yang dilakukan. Nilai rendemen ekstrak kulit batang api-api pada maserasi partisi menggunakan metanol, etil asetat dan n-heksan secara berturut-turut yaitu 7,256%, 1,647% dan 0,273%. Hasil dari ekstraksi maserasi bertingkat menunjukkan bahwa rendemen ekstrak tertinggi yaitu metanol sebesar 8,017%, diikuti dengan n-heksan sebesar 0,444% dan etil asetat sebesar 0,386%.
Berdasarkan Gambar 8 diketahui bahwa rendemen ekstrak kasar kulit batang api-api tertinggi diperoleh dari pelarut metanol, mengindikasikan bahwa senyawa-senyawa bioaktif pada kulit batang api-api cenderung larut pada pelarut metanol. Komponen bioaktif semi polar dan non polar terhitung sedikit sehingga rendemen ekstrak kasar etil asetat dan n-heksan yang dihasilkan bernilai kecil. Hasil serupa diperoleh dari penelitian Fitrial et al. (2008) yang mengekstrak biji teratai menggunakan tiga pelarut yaitu etanol, etil asetat dan n-heksan. Penelitian
7,256 8,017 1,647 0,386 0,273 0,444 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ekstraksi maserasi partisi Ekstraksi maserasi bertingkat
Rend
em
en
(%
tersebut menunjukkan rendemen tertinggi diperoleh dari pelarut polar (etanol). Nurhayati et al. (2010) dalam penelitiannya mengenai aktivitas inhibitor protease ekstrak karang lunak, melaporkan bahwa rendemen ekstrak tertinggi dihasilkan oleh metanol, jauh melebihi rendemen ekstrak dari etil asetat dan n-heksan.
Metanol dikenal sebagai pelarut universal dan termasuk dalam golongan alkohol. Alkohol adalah pelarut serbaguna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan untuk mengekstraksi habis senyawa bioaktif. Pelarut yang bersifat polar seperti metanol mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asam amino, dan glikosida (Harborne 1987).
4.2 Aktivitas Antimikroba Ekstrak Kulit Batang Api-Api (Avicennia marina) Uji aktivitas antimikroba ekstrak kasar metanol, etil asetat dan n-heksan kulit batang api-api dari hasil maserasi partisi dan maserasi bertingkat dilakukan terhadap bakteri dan fungi patogen. Bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus untuk mewakili bakteri Gram-positif dan Escherichia coli untuk mewakili Gram-negatif, sedangkan fungi uji yang digunakan yaitu khamir (Candida albicans) dan kapang (Microsporum gypseum).
Tiap ekstrak dari masing-masing pelarut diujikan dengan tiga jumlah ekstrak per sumur yang berbeda. Kontrol positif yang digunakan untuk bakteri adalah kloramfenikol dengan jumlah 0,3 µg/sumur dan untuk fungi adalah ketoconazol dengan jumlah 0,3 µg/sumur. Kontrol negatif yang digunakan yaitu pelarut yang sesuai dengan ekstraknya. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak kulit batang api-api disajikan pada Tabel 1.
Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa ekstrak etil asetat kulit batang api- api dari maserasi partisi dan maserasi bertingkat memiliki diameter zona hambat terbesar. Ekstrak etil asetat kulit batang api-api maserasi partisi hanya memiliki aktivitas antimikroba terhadap S. aureus, sedangkan esktrak etil asetat kulit batang api-api maserasi bertingkat memiliki aktivitas antimikroba terhadap E. coli, S. aureus dan M. gypseum. Esktrak etil asetat hasil maserasi bertingkat memiliki aktivitas yang lebih tinggi daripada ekstrak etil asetat hasil maserasi partisi karena dapat menghambat pertumbuhan tiga mikroorganisme uji. Ekstrak etil asetat hasil maserasi bertingkat pada jumlah yang lebih kecil (1 µg/sumur) sudah menunjukkan aktivitas antimikroba dibandingkan dengan eksrak etil asetat hasil
Tabel 1. Hasil pengujian aktivitas antimikroba ekstrak kulit batang api-api (A. marina)
Metode
ekstraksi Bakteri
Diameter zona hambat (mm) Ekstrak Metanol
(per sumur)
Ekstrak Etil asetat (per sumur)
Ekstrak N-heksan
(per sumur) Kontrol
positif Kontrol negatif 2 mg 1 mg 0,5 mg 2 mg 1 mg 0,5 mg 2 mg 1 mg 0,5 mg Maserasi partisi E. coli - - - 37,1 ± 0,25 - S. aureus - - - 9,4 ± 0,15 - - - 37,5 ± 3,02 - M. gypseum - - - - C. albicans - - - 24,4 ± 1,27 - Maserasi bertingkat E. coli - - - 11,7 ± 0,40 10 ± 0,01 - - - - 55,5 ± 0,97 - S. aureus - - - 19,6 ± 0,58 14,6 ± 0,58 - - - - 52,4 ± 4,78 - M. gypseum - - - 12,3 ± 2,52 10,3 ± 1,53 - - - - 23,0 ± 1,56 - C.albicans - - - 39,8 ± 3,27 - Keterangan:
Kontrol + bakteri : kloramfenikol Kontrol + fungi : ketoconazol Kontrol - metanol : metanol Kontrol - etil asetat : etil asetat Kontrol - n-heksan : n-heksan
partisi dimana aktivitas antimikroba ditunjukkan pada jumlah 2 µg/sumur, sebaliknya ekstrak metanol dan n-heksan tidak memiliki aktivitas terhadap keempat mikroorganisme uji.
Zona hambat yang ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat maserasi partisi yaitu sebesar 5-10 mm. Hal ini menunjukkan kekuatan senyawa antimikroba yang sedang. Kekuatan antibakteri ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat tergolong kuat (diameter zona hambat 10-20 mm). Kloramfenikol dan ketoconazol sebagai kontrol positif, menunjukkan aktivitas antibakteri yang sangat kuat karena memiliki zona hambat lebih dari 20 mm. Menurut Davis dan Stout (1971), ketentuan kekuatan antibiotik-antibakteri sebagai berikut: daerah hambatan 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, daerah hambatan 10-20 mm (kuat), daerah hambatan 5-10 mm (sedang), dan daerah hambatan 5 mm atau kurang (lemah).
Berdasarkan Tabel 1, ekstrak etil asetat yang memiliki aktivitas antimikroba terbaik dibandingkan ekstrak lainnya. Kemampuan antimikroba senyawa semi polar yang terlarut dalam etil asetat diduga berkaitan dengan komponen dinding sel bakteri. Menurut Fitrial et al. (2008) dinding sel bakteri tidak bersifat absolut hidrofobik maupun absolut hidrofilik, begitu pula senyawa semi polar diketahui memiliki dua sifat kelarutan yaitu hidrofilik dan lipofilik. Senyawa semi polar dapat lebih baik berinteraksi dengan dinding sel bakteri karena sifat tersebut. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa dapat larut dalam fase air yang merupakan tempat hidup mikroba dan senyawa yang bekerja pada membran sel yang hidrofobik memerlukan sifat lipofilik.
Etil asetat mampu mengestrak senyawa fenol dan terpenoid/steroid (Harborne 1987). Kedua senyawa tersebut diduga terdapat dalam ekstrak etil asetat sehingga berperan dalam aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat. Angeh et al. (2007) melaporkan bahwa senyawa triterpenoid dari daun Crobretum padoides memiliki aktivitas antibakteri tanpa aktivitas sitotoksik. Haq et al. (2011) dalam penelitiannya mengenai aktivitas antimikroba dan antioksidan mangrove Bruguiera gymnorrhiza, melaporkan bahwa senyawa fenolik memiliki aktivitas antimikroba terhadap beberapa bakteri.
Ekstrak kasar metanol tidak menunjukkan aktivitas antibakteri dan antifungi terhadap keempat mikroorganisme uji. Metanol merupakan pelarut universal yang dapat melarutkan hampir sebagian besar komponen senyawa bioaktif. Senyawa-senyawa pada ekstrak metanol terdiri atas senyawa antimikroba dan senyawa bukan antimikroba. Pada pengujian aktivitas antimikroba, jumlah ekstrak yang digunakan dari masing-masing ekstrak sama besar. Pada jumlah tersebut diduga jumlah senyawa antimikroba lebih sedikit daripada senyawa bukan antimikroba pada ekstrak metanol, jika dibandingkan dengan ekstrak lain. Akibatnya aktivitas terhadap bakteri dan fungi tidak terlihat. Pelarut metanol dapat melarutkan sebagian besar senyawa bioaktif beserta gula, asam amino, dan glikosida (Harborne 1987). Senyawa-senyawa tersebut diduga terdapat dalam ekstrak metanol.
Ekstrak n-heksan tidak memiliki aktivitas antimikroba yang ditunjukkan oleh tidak terbentuknya zona hambat pertumbuhan pada keempat mikroorganisme
uji. Pelarut n-heksan merupakan pelarut yang bersifat non polar. Ekstrak n-heksan. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa ekstrak yang memiliki aktivitas
antibakteri bukan termasuk kelompok senyawa non polar.
Pengujian aktivitas antibakteri terhadap S. aureus menunjukkan zona hambat yang lebih besar bila dibandingkan dengan E. coli. Hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri Gram-positif lebih sensitif daripada bakteri Gram- negatif terhadap senyawa antimikroba pada penelitian ini. Kesensitifan terhadap antimikroba diduga disebabkan oleh perbedaan komponen dinding sel kedua jenis bakteri.
Bakteri Gram-positif lebih sensitif daripada bakteri Gram-negatif terhadap antibiotik, walaupun beberapa antibiotik hanya bekerja pada bakteri Gram-negatif (Brock dan Madigan 1991). Komponen penyusun dinding sel bakteri Gram- positif hanya terdiri asam teikhik dan lapisan peptidoglikan. Dinding sel bakteri Gram-negatif jauh lebih komleks dan lebih banyak dari bakteri Gram-positif, yaitu membran luar, porin, lipopolisakarida, lipoprotein, lapisan peptidoglikan dan ruang periplasma (Coyle 2005). Nikaido dan Vaara (1985) menyatakan bahwa struktur lipopolisakarida yang berada pada membran fosfolipid juga membuat dinding sel menjadi tidak dapat ditembus molekul lipofilik. Bakteri Gram-positif
hanya memiliki bagian luar berupa lapisan peptidoglikan yang lebih rentan sehingga menjadi penghalang yang tidak efektif.
Pada pengujian aktivitas antifungi, ekstrak etil asetat pada maserasi bertingkat menunjukkan aktivitas antifungi terhadap M. gypseum dan terhadap C. albicans tidak ada aktivitas. Penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat efektif menghambat pertumbuhan fungi M. gypseum namun tidak efektif terhadap C. albicans. Pernyataan ini didukung oleh Shukla et al. (2011), bahwa senyawa yang memiliki aktivitas fungisidal terhadap fungi tertentu bisa jadi tidak efektif terhadap patogen lain. Menurut LaFleur (2011) C. albicans membentuk komunitasnya dengan membentuk ikatan koloni yang disebut biofilm. Biofilm C. albicans terbentuk ketika satu sel melekat pada permukaan benda dan tumbuh menjadi mikrokoloni, menyatu dan menghasilkan struktur komplek tiga dimensi yang diikat bersama oleh hifa dan matrik exopolimer. Biofilm berisi campuran dari khamir, hifa dan pseudohifa. Biofilm tersebut dapat berfungsi sebagai pelindung, sehingga mikroba yang membentuk biofilm biasanya mempunyai resistensi terhadap antimikroba biasa. Hal ini menjadi penyebab ekstrak kasar kulit batang api-api