II. TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Metode Analisis Senyawa Fenolat
Beberapa tinjauan telah dipublikasikan tentang analisis senyawa-senyawa fenolat dalam tumbuh-tumbuhan (Harborne, 1989; Waterman dan Mole, 1994; Harborne, 1998) dan dalam makanan yang berasal dari tumbuhan (Macheix et al., 1990; Lee dan Widmer, 1996). Sedangkan Hermann (1989) dan Waksmundzka-Hajnos (1998) telah meninjau analisis asam hidroksisinamat dan asam hidroksibenzoat dalam tumbuh-tumbuhan dan makanan yang berasal dari tumbuhan. Analisis flavonoid juga telah ditinjau secara luas oleh Markham (1982, 1989), oleh Harborne (1988, 1994) dan oleh Robards dan Antolovich (1997).
Analisis senyawa fenolat dalam matriks obat bahan alam, makanan mentah ataupun makanan olahan dimulai dengan ekstraksi. Prosedur ekstraksi tergantung pada jenis bahan yang akan dianalisis, senyawa fenolat yang akan ditentukan, dan prosedur analisis yang akan digunakan (Lee dan Widmer, 1996). Tahap pertama adalah menghancurkan bahan, menggiling dan memaserasi sampel untuk meningkatkan luas permukaan, sehingga memungkinkan kontak yang lebih baik antara pelarut pengekstraksi dengan sampel (Waterman dan Mole, 1994). Proses ini juga membantu pencampuran sampel untuk menjamin bahwa bagian yang diekstraksi mewakili keseluruhan sampel. Karena beberapa senyawa fenolat terdapat sebagai glikosida atau ester, maka penyiapan sampel bisa meliputi
hidrolisis dengan asam, basa atau enzimatik untuk membebaskan senyawa-senyawa fenolat yang terikat. Tahap hidrolisis diabaikan jika senyawa-senyawa fenolat itu akan dianalisis sebagai turunannya.
2.3.1 Analisis Flavonoid
2.3.1.1 Teknik-teknik Ekstraksi dan Hidrolisis Flavonoid
Umumnya senyawa flavonoid adalah senyawa yang stabil dan bisa diekstraksi dari bahan tumbuhan segar, kering atau yang telah digiling, dengan pelarut dingin atau panas. Pelarut yang cocok untuk ekstraksi senyawa fenolat adalah campuran air dengan etanol, metanol, aseton atau dimetilformamida (Robards dan Antolovich, 1997). Ekstraksi flavonol telah dilakukan dengan maserasi bahan tumbuhan segar dalam pelarut pengekstraksi (Wildanger dan Herman, 1973; Bilyk dan Sapers, 1986; Dick et al., 1987; Price et al., 1999), dengan ekstraksi sampel buah-buahan segar yang dihomogenkan (Amiot et al., 1995; Heinonen et al., 1998) atau dengan ekstraksi sampel yang dikering-bekukan (liofilisasi) (Hertog et al., 1992a,b; Crozier et al., 1997; Justesen et al., 1998).
Analisis kuantitatif masing-masing flavonol glikosida dalam buah-buahan sulit karena kebanyakan senyawa pembanding tidak sedia dalam perdagangan. Selain itu, lebih dari 30 jenis senyawa flavonol glikosida telah diidentifikasi dalam buah-buahan (Macheix et al., 1990). Hidrolisis flavonol glikosida menjadi aglikonnya masing-masing memberikan metode yang praktis untuk kuantifikasi flavonol dalam makanan (Robards dan Antolovich, 1997). Hidrolisis flavonol dengan asam hidroklorida (HCl) telah dijelaskan oleh Harborne (1965). Wildanger dan Hermann (1973) dan Bylik dan Sapers (1986) menyelidiki
kandungan flavonol dalam buah-buahan dengan menggunakan hidrolisis asam tetapi tanpa optimasi prosedur ekstraksi dan hidrolisis. Hertog et al. (1992a) telah mengoptimasi ekstraksi dan kondisi hidrolisis asam (dalam metanol berair dengan HCl) untuk analisis flavonol dan flavon dalam sayur-sayuran dan buah-buahan yang dikering-bekukan. Ekstraksi dan hidrolisis dalam metanol berair dengan HCl telah digunakan pula untuk menyelidiki flavonoid aglikon pada sayur-sayuran dan buah-buahan oleh Justesen et al. (1998) dan Ewald et al. (1999). Rommel dan Wrolstad (1993a,b) menggunakan hidrolisis basa (NaOH 2N) untuk menyelidiki flavonol, asam hidroksisinamat dan asam hidroksibenzoat dalam buah-buahan. Laju hidrolisis asam/basa dari glikosida tergantung pada kekuatan asam/basa, sifat bagian gula dan posisinya pada inti flavonoid.
Hidrolisis enzimatik memberikan metode yang cepat untuk pemutusan monosakarida khusus dari flavonoid-O-glikosida. Hidrolisis enzimatik dengan enzim -gluronidase dan sulfatase telah digunakan untuk menyelidiki flavonoid dalam plasma manusia oleh Manach et al. (1998) dan Erlund et al. (1999).
2.3.1.2 Teknik-teknik Kromatografi Flavonoid
Metode kromatografi kertas dikembangkan untuk flavonoid dalam tahun 1950-an dan 1960-an (Markham, 1982, Robards dan Antolovich, 1997). Teknik ini digantikan oleh kromatografi lapis tipis (KLT) dalam tahun 1970-an yang menyediakan teknik yang murah dan bermanfaat untuk analisis secara bersamaan beberapa sampel sekaligus (Robards dan Antolovick, 1997; Harborne, 1998). Pemilihan fase diam dan pelarut yang sesuai tergantung pada golongan flavonoid yang akan diperiksa. Flavonoid yang bersifat hidrofilik, seperti flavonol, dapat
dipisahkan dengan mudah dengan KLT pada fase diam poliamida atau mikrokristalin selulosa (Wildamer dan Herman, 1973; Robards dan Antolovich, 1997). KLT masih lazim digunakan untuk pemisahan preparatif (Lee dan Widmer, 1996) dan sebagai metode skrining yang cepat dan murah untuk menentukan golongan flavonoid yang ada dalam buah-buahan (Fernandez de Simon et al., 1992) dan madu (Sabatier et al., 1992).
Kromatografi gas (KG) terbatas pemakaiannya pada analisis flavonoid dan senyawa fenolik lainnya karena kemudahannya menguap juga terbatas. Karena itu ada tahap tambahan yang diperlukan untuk menjamin kemudahan menguap senyawa fenolik itu (Lee dan Widmer, 1996; Robards dan Antolovich, 1997). Namun demikian, analisis KG dengan deteksi spektrometri massa (MS) telah digunakan untuk analisis flavonol dalam teh hitam (Finger et al., 1991) dan kubis (Nielsen et al., 1993). Keuntungan analisis KG adalah meningkatnya pemisahan isomer-isomer yang berkaitan erat dan sederhananya penggandengan dengan detektor MS untuk identifikasi melalui pola fragmentasi (Mouly et al., 1993; Schmidt et al., 1994).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) telah menjadi teknik kromatografi yang paling banyak digunakan dalam analisis flavonoid dewasa ini (Harborne, 1988; Robards dan Antolovich, 1997; Merken dan Beecher, 2000). Teknik ini telah menambah dimensi baru pada penyelidikan flavonoid dalam tumbuhan-tumbuhan dan ekstraknya. Keuntungan utamanya adalah meningkatnya resolusi campuran flavonoid dibandingkan dengan teknik kromatografi lainnya, kemampuannya memperoleh data kualitatif dan data kuantitatif yang teliti dalam satu operasi, tingginya kecepatan analisis (Harborne, 1988; Markham, 1989).
Kromatografi fase-normal telah digunakan untuk pemisahan flavonoid (flavon, flavonol dan flavanon aglikon) dalam air jeruk (Galensa dan Hermann, 1980a,b). Flavonoid dipisahkan secara isokratik pada LiChrosorb Si60 dengan menggunakan sistem pelarut benzena-asetonitril, benzena-etanol atau iso-oktana-etanol-asetonitril dan dideteksi pada 312 atau 270 nm. Akan tetapi, untuk sistem fase-normal, ada kekhawatiran bahwa senyawa yang sangat polar bisa tertahan secara irreversibel dalam kolom sehingga karakteristik pemisahannya dapat berubah secara berangsur-angsur (Vande Cateele et al., 1983).
Oleh karena adanya keterbatasan kromatografi fase-normal, maka kromatografi fase-terbalik telah menjadi metode pilihan untuk pemisahan senyawa-senyawa fenolat dalam tumbuh-tumbuhan. Senyawa-senyawa fenolat yang berasal dari alam mempunyai sifat yang dapat larut dalam pelarut polar. Sifat ini mendorong ke arah kemungkinan penggunaan KCKT fase terbalik dalam analisis senyawa-senyawa fenolat. Waktu retensi yang cukup akan dicapai dengan menggunakan kondisi asam untuk menghindarkan adanya bentuk terionisasi dari analit (Waksmundzka-Hajnos, 1998). Oktadesilsilan (ODS, C18, RP-18) adalah fase diam yang paling populer, baik untuk analisis secara umum maupun untuk analisis senyawa-senyawa fenolat (Majors, 2001). Bahan-bahan fase-terbalik lainnya (misalnya C8) jarang dipakai (Robards dan Antolovich, 1997), karena produk itu tidak tersedia di pasaran (Majors, 2001). Walaupun demikian, tanin terkondensasi tidak bisa dianalisis dengan menggunakan KCKT fase terbalik karena senyawa itu terserap terlalu kuat pada fase diam (Schofield et al., 1998). Oleh karena itu, tanin terkondensasi harus dianalisis dengan menggunakan teknik KCKT fase normal (Waksmundzka-Hajnos, 1998).
Eluen yang digunakan dalam analisis KCKT fase terbalik untuk senyawa-senyawa fenolat adalah campuran zat pengubah pH air dengan pelarut organik polar yang larut-air: metanol (MeOH), asetonitril (ACN) atau tetrahidrofuran (THF). Walaupun THF mempunyai keuntungan tersendiri karena keselektifannya, namun pelarut ini jarang dipakai karena mudah terurai, waktu kesetimbangannya lama, beracun, dan serapan latar belakang ultravioletnya tinggi di bawah 240 nm (Dolan, 2000). Namun demikian, beberapa metode yang menggunakan THF sebagai pelarut organik dalam fase gerak telah dipublikasikan (Dick et al., 1987). Pelarut-pelarut organik lain seperti 2-propanol dan n-butanol jarang dipakai dalam fase gerak, namun bila dipakai, itu disebabkan terutama karena alasan keselektifannya (Bronner dan Beecher, 1995).
Zat pengubah pH yang berupa senyawa organik pada konsentrasi rendah dapat pula mempunyai pengaruh yang besar pada waktu retensi senyawa fenolat (Arin et al., 1995). Sedangkan pH adalah salah satu faktor penting terutama dalam pemisahan senyawa-senyawa yang dapat terionisasi seperti asam-asam fenolat. Zat pengubah pH yang paling sering digunakan dalam metode KCKT fase terbalik untuk senyawa-senyawa fenolat adalah asam formiat, asam asetat, asam trifluoroasetat dan asam fosfat, serta buffer fosfat yang diatur pada pH asam untuk mencapai bentuk tak terionisasi dari analit-analit fenolat (Robards dan Antolovich, 1997, Waksmundzka-Hajnos, 1998).
2.3.2 Analisis Asam Fenolat
Pelarut yang lazim digunakan untuk ekstraksi asam-asam fenolat matriks tumbuhan adalah etil asetat (Azar et al., 1987; Fernandez de Simon et al., 1990, 1992), dietil eter (Fernandes de Simon et al., 1990,1992) metanol atau metanol berair (Kuninori dan Nishiyama, 1986; Torres et al., 1987; McRae et al., 1990; Tomas-Lorente, 1992). Hidrolisis enzimatik dengan enzim -glukosidase (Kanes et al., 1993) atau enzim hidrosinamoil-kuinat esterase (Goupy et al., 1990) telah digunakan untuk analisis asam-asam fenolat. Namun demikian, hidrolisis asam dan basa lebih lazim digunakan untuk penentuan asam-asam fenolat dalam tumbuh-tumbuhan (Lee dan Widmer, 1996).
Hidrolisis asam untuk penentuan asam-asam fenolat telah dilakukan dengan cara memanaskan sampel dengan asam klorida (HCl) selama 2 jam atau lebih (Kuninori dan Nishiyama, 1986). Hidrolisis ester asam benzoat dan ester asam sinamat dengan basa dapat dilakukan dengan natrium hidroksida (NaOH) pada suhu kamar selama 4-24 jam (Seo dan Morr, 1984; Torres et al., 1987; Peleg et al., 1991; Roussef et al., 1992a,b; Rommel dan Wrolstad, 1993a). Rommel dan Wrolstad (1993a) menguji hidrolisis asam (HCl) dan basa (NaOH) dalam analisis komposisi senyawa fenolat (asam elegat, asam hidroksibenzoat, asam hidroksisinamat, favonol dan flavan-3-ol) dari air buah raspberi. Pola senyawa fenolat sampel yang dihidrolisis basa sangat serupa dengan pola senyawa fenolat sampel yang dihidrolisis asam. Hanya satu senyawa asam elegat terhidrolisis lebih efektif dalam kondisi basa daripada dalam kondisi asam. Perolehan kembali (recovery) sangat jelek (57-67 %) untuk asam hidroksisinamat yang diekstraksi dari air buah setelah hidrolisis basa (Peleg et al., 1991). Namun demikian, Seo dan Morr (1984) menemukan bahwa hidrolisis dengan NaOH menyebabkan
perolehan kembali asam ferulat dari produk protein kedele lebih baik daripada hidrolisis dengan HCl. Hollman dan Venema (1993) menguji ekstraksi dan hidrolisis asam elegat dari kenari dan buah-buahan dengan menggunakan berbagai konsentrasi HCl dan metanol dalam air bersama-sama dengan variasi lamanya hidrolisis. Karakteristik hidrolisis elegitanin dari kenari (optimum HCl 5 M dalam metanol 57% selama 1 jam) berbeda dari karakteristik hidrolisis buah-buahan (optimum HCl 3,5 M dalam metanol 72% selama 4-8 jam). Pada umumnya, optimisasi ekstraksi dan kondisi hidrolisis selalu diperlukan bila asam-asam fenolat ditentukan kadarnya dari buah-buahan atau bahan tumbuhan lainnya (Lee dan Widmer, 1996).
2.3.2.2 Teknik-teknik Kromatografi untuk Asam Fenolat
Pemakaian kromatografi lapis tipis (KLT) untuk analisis kuantitatif asam-asam fenolat (Azar et al., 1987; Regnault-Roger et al., 1987; Srisuma et al., 1989) biasanya dilakukan dengan menggunakan kromatografi fase-normal pada lapisan tipis selulosa atau silika dan fase gerak campuran pelarut nonpolar (toluen, dioksan atau benzena) dan zat pengubah organik polar (aseton, butanol, etanol atau asam asetat). Keuntungan penapisan ekstrak sampel dengan KLT sebelum analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah deteksi kotoran yang bisa terserap pada fase diam dalam kolom KCKT, atau penentuan kondisi pelarut yang perlu untuk berhasilnya pemisahan senyawa-senyawa fenolat (Fernandez de Simon et al., 1992; Lee dan Widmer, 1996).
Pada tahun 1980-an, kromatografi gas (KG) digunakan untuk analisis asam-asam fenolat dalam buah-buahan (Moller dan Hermann, 1983; Schuster dan
Herrmann, 1985) dan sayur-sayuran (Huang et al., 1986). Namun demikian, KCKT, terutama KCKT fase-terbalik, adalah metode pilihan dalam analisis asam-asam fenolat. Sistem pelarut yang digunakan dalam analisis KCKT biasanya meliputi elusi gradien biner dengan menggunakan pelarut larutan asam asetat, asam formiat atau asam fosfat dalam air dengan memakai metanol atau asetonitril sebagai zat pengubah kepolaran organik. Kekuatan ionik dan pH fase gerak diketahui mempengaruhi retensi senyawa-senyawa fenolat dalam kolom yang tergantung pada protonasi, disosiasi, atau disosiasi parsial (Marko-Varga dan Barcelo, 1992). Perubahan pH yang meningkatkan ionisasi suatu sampel dapat mengurangi retensi dalam pemisahan fase-terbalik. Jadi, sejumlah kecil asam asetat (2-5%), asam formiat, asam fosfat atau asam trikloroasetat (0,1%) dimasukkan ke dalam sistem pelarut untuk menekan ionisasi gugus fenolat dan gugus karboksilat dan karena itu meningkatkan resolusi dan keterulangan proses kromatografi.
2.3.3 Deteksi dan Identifikasi Senyawa-senyawa Fenolat
Senyawa-senyawa fenolat menyerap dalam daerah ultraviolet (UV) dan detektor yang lazim dipakai untuk KCKT adalah detektor panjang gelombang bervariasi UV atau UV-Visible (Lee dan Widmer, 1996; Robards dan Antolovich, 1997). Tidak ada satu panjang gelombang yang ideal untuk memantau semua golongan senyawa fenolat kerena mereka memperlihatkan serapan maksimum pada berbagai panjang gelombang (Delage et al., 1991). Kebanyakan turunan asam benzoat memperlihatkan serapan maksimum pada 246-262 nm, kecuali untuk asam galat dan asam siringat yang mempunyai serapan maksimum pada 271
dan 275 nm, masing-masing (Torres et al., 1987). Turunan asam hidroksisinamat menyerap pada dua daerah UV, satu serapan maksimum pada rentang 225-235 nm dan satu lagi pada rentang 290-330 nm (Ribereau-Gayon, 1972). Pada 320 nm, turunan asam sinamat dapat dideteksi tanpa gangguan dari turunan asam benzoat, yang mempunyai daya serap lebih tinggi pada 254 nm. Namun demikian, deteksi pada 280 nm adalah pilihan terbaik untuk penentuan kedua golongan senyawa fenolat itu (Pussayanawin dan Wetzel, 1987). Rentang serapan pada panjang gelombang 350-370 nm telah banyak digunakan untuk flavonol aglikon dan panjang gelombang 280 nm untuk flavan-3-ol dan flavonol glikosida (Robard dan Antolovich, 1997).
Luasnya penggunaan photo-diode array (PDA) dalam analisis flavonoid dan asam fenolat dapat disebabkan oleh kemampuannya mengumpulkan spektrum secara on-line (Hertog et al., 1992a,b; Rommel dan Wrolstad, 1993a,b; Justesen et al., 1998) tanpa menggunakan teknik aliran-terhenti. Ini telah mendorong banyaknya peningkatan analisis KCKT untuk tujuan identifikasi dan membuktikan manfaat informasi kualitatif dalam analisis senyawa fenolat yang didasarkan pada spektrum serapan (Jaworski dan Lee, 1987; Mazza dan Velioglu, 1992, Fernandez de Simon et al., 1992). PDA mempunyai tiga keuntungan utama: deteksi panjang gelombang berganda, identifikasi puncak, dan penentuan kemurnian puncak (Lee dan Widmer, 1996).
Deteksi fluoresensi lebih peka dan lebih selektif daripada deteksi UV. Namun demikian, deteksi fluoresensi belum banyak dipakai pada analisis senyawa fenolat (Lee dan Widmer, 1996). Dalam analisis senyawa fenolat dalam air jeruk, deteksi fluoresensi memberikan keuntungan yang lebih baik daripada deteksi UV
dalam kaitan dengan peningkatan keselektifan dan kepekaannya (Roussef et al., 1992b). Deteksi fluoresensi telah dipakai pula untuk analisis asam-asam fenolat dalam buah kesemak (Gorinstein, 1994), asam elegat dalam buah berry dan kacang (Hollman dan Venema, 1993), dan flavonol (Hollman et al., 1996) dan isomer resveratrol dalam plasma (Giachetti et al., 1999).
Deteksi elektrokimia sangat peka untuk senyawa-senyawa yang dapat dioksidasi atau direduksi pada potensial voltage rendah. Deteksi elektrokimia menjadi semakin penting untuk penentuan jumlah senyawa fenolat yang sangat kecil, karena deteksi elektrokimia ini memperlihatkan kepekaan dan keselektifan yang lebih meningkat dibandingkan dengan deteksi UV (van Sumere, 1989; Akasbi et al., 1993). Deteksi elektrokimia telah digunakan untuk deteksi flavonol dan asam fenolat dalam sayur-sayuran (Chiavari et al., 1988), minuman (Lunte, 1987), dan plasma (Erlund et al., 1999).
Metode gabungan kromatografi cair kinerja tinggi dengan spektrometri massa (KCKT-SM) adalah metode yang yang cepat dan handal untuk analisis struktur senyawa-senyawa fenolat yang tidak mudah menguap, semenjak teknik-teknik yang lebih baik telah dikembangkan untuk pemisahan fase gerak cair sebelum ionisasi (Careri et al., 1998). Pietta et al. (1994) memperlihatkan bahwa termospray liquid chromatography (LC)-MS adalah suatu teknik yang sangat baik untuk analisis flavonol glikosida dari tumbuhan obat. Flavan-3-ol (Lin et al., 1993) dan berbagai golongan fenolat termasuk flavonol glikosida (Kiehne dan Engelhardt, 1996) dalam teh telah diselidiki dengan menggunakan thermospray LC-MS. Positive ion fast atom bambardment (FAB)-MS telah digunakan untuk menyelidik ikatan glikosida dalam diglikosil flavonoid (Li dan Claeys, 1994).
Electrospray dan variasinya adalah perkembangan yang lebih baru dalam spektrometri massa ionisasi pada tekanan atmosfer (Robards dan Antolovich, 1997). Teknik gabungan HPLC-electospray ionisation (ESI)-MS memberikan keuntungan dalam kaitannya dengan kepekaan dan kapasitas untuk analisis senyawa-senyawa yang sangat polar dan labil secara termal (Robards dan Antolovich, 1997; Careri et al., 1998). HPLC-ESI-MS telah digunakan utnuk menyelidiki flavonoid dalam teh (Poon, 1998) dan dalam tomat dan plasma (Mauri et al, 1999). Teknik atmospheric pressure ionisastion (API)-MS telah digunakan untuk analisis flavonoid dalam buah-buahan dan sayur-sayuran (Justesen et al., 1998).