III. BAHAN DAN METODE
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Penentuan pengaruh cara pengeringan terhadap perolehan kadar senyawa fenolat total dan daya antioksidan beberapa obat bahan alam
1. Bahan tumbuhan obat dikumpulkan dari lapangan dan disimpan dalam kantong plastik selama perjalanan ke laboratorium untuk mempertahankan kesegarannya
2. Bahan tumbuhan obat segar itu dipisahkan menjadi empat kelompok. 3. Masing-masing kelompok diberi perlakuan sebagai berikut:
a. Kelompok 1 dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di dalam ruangan bersirkulasi udara yang baik, kemudian ditimbang. Pengeringan dilanjutkan sampai bobotnya konstan (lebih kurang seminggu).
b. Kelompok 2 dikeringkan dalam oven pada suhu 40 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang setelah didinginkan sampai suhu kamar. Pengeringan dan penimbangan diulangi setiap jam sampai bobotnya konstan (lebih kurang 9 jam).
c. Kelompok 3 dikeringkan dalam oven pada suhu 60 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang setelah didinginkan sampai suhu kamar. Pengeringan dan penimbanan diulangi setiap jam sampai bobotnya konstan (lebih kurang 6 jam).
d. Kelompok 4 dikeringkan dalam oven microwave pada suhu ± 40
o
C selama 1 menit, kemudian ditimbang setelah didinginkan sampai suhu kamar. Pengeringan dan penimbangan diulangi setiap menit sampai bobot konstan (lebih kurang 5 menit).
4. Masing masing kelompok diekstraksi dengan cara merendam sebanyak 5 g serbuk kering tumbuhan obat tersebut dalam 50 ml larutan etanol 50 % selama 24 jam sambil sekali-sekali diaduk, kemudian disaring dan ulangi ekstraksi beberapa kali dengan 50 ml larutan etanol 50 % sampai filtrat terakhir tidak berwarna lagi. Kumpulkan hasil saringan dan uapkan dengan penguap putar pada suhu < 50 oC sampai kental.
5. Masing-masing ekstrak kental dilarutkan dalam campuran metanol-air (1:1) dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditentukan kadar ekstraktif (rendemen) dengan cara pada bagian 3.3.4, kadar senyawa fenolat total
dengan cara pada bagian 3.3.5 dan aktivitas antioksidan dengan cara pada bagian 3.3.6.
6. Prosedur 1 sampai 5 diulangi dua kali lagi untuk ketiga jenis tumbuhan obat yang diteliti.
3.3.2 Penentuan pengaruh pelarut ekstraksi terhadap perolehan kadar senyawa fenolat total dan daya antioksidan beberapa obat bahan alam
1. Bahan tumbuhan obat dikeringkan dengan pengeringan yang paling cocok sesuai dengan percobaan optimasi pengeringan di atas.
2. Bahan tumbuhan obat kering dibagi menjadi tiga kelompok, masing-masing ditimbang seksama sebanyak 5 g dan diekstraksi dengan cara seperti di atas, dengan mengganti pelarutnya sebagai berikut:
a. Kelompok 1 dengan pelarut etanol 50 % b. Kelompok 2 dengan pelarut metanol 50 % c. Kelompok 3 dengan pelarut aseton 50%
3. Masing-masing ekstrak dilarutkan dalam campuran metanol-air (1:1) dalam labu ukur 10 ml, kemudian ditentukan kadar ekstraktif (rendemen), kadar senyawa fenolat total dan aktivitas antioksidannya.
4. Prosedur 1 sampai 3 diulangi dua kali lagi.
5. Jenis pelarut yang optimal dioptimasi lagi dengan memvariasikan konsentrasi pelarut ekstraksi untuk mendapatkan perbandingan pelarut dan air yang optimum.
3.3.3 Penentuan pengaruh cara ekstraksi terhadap perolehan kadar senyawa fenolat total dan daya antioksidan beberapa obat bahan alam
1. Bahan tumbuhan obat yang telah dikeringkan dengan cara pengeringan yang cocok, ditimbang seksama sebanyak 5 gram, diekstraksi dengan empat cara ekstraksi menggunakan pelarut yang paling cocok sesuai percobaan di atas:
a. Ekstraksi dengan cara maserasi dengan 50 mL pelarut yang cocok selama 24 jam dan setelah disaring, ampasnya dimaserasi lagi beberapa kali dengan pelarut baru sampai maserat terakhir tidak bersisa bila diuapkan.
b. Ekstraksi dengan cara perkolasi dengan pelarut yang cocok sampai perkolat terakhir tidak bersisa lagi bila diuapkan.
c. Ekstraksi dengan cara refluks dengan pelarut yang cocok selama satu jam dan setelah disaring, ampasnya direfluks lagi dengan pelarut baru sampai ekstrak terakhir tidak bersisa lagi bila diuapkan.
d. Ekstraksi dengan cara sokletasi sampai tetesan terakhir tidak berwarna
2. Masing-masing ekstrak diuapkan dengan penguap putar pada suhu < 50 oC sampai kental.
3. Masing-masing ekstrak kental dilarutkan dalam campuran metanol-air (1:1) dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditentukan kadar ekstraktif (rendemen), kadar senyawa fenolat total dan aktivitas antioksidannya.
4. Prosedur 1 sampai 3 diulangi dua kali lagi.
3.3.4 Penentuan kadar ekstraktif (rendemen)
Penentuan kadar ekstraktif (rendeman) ekstrak yang diperoleh dengan berbagai cara di atas dilakukan menurut metode WHO (1998) sebagai berikut:
1. Larutan ekstrak yang telah disiapkan dengan cara-cara di atas dipipet sebanyak 10 mL ke dalam piring penguap yang telah ditara.
2. Pelarutnya diuapkan di atas pengas air sampai kering.
3. Sisa pengeringan itu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 OC selama 6 jam, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit lalu segera ditimbang.
4. Kadar ekstraktif (rendemen) dihitung dalam satuan mg per g simplisia kering.
3.3.5 Penentuan kadar senyawa fenolat total
Senyawa fenolat total dalam larutan sampel ditentukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteau menggunakan prosedur Pourmorad et al. (2006) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Larutan encer masing-masing ekstrak tumbuhan obat (0,5 ml ekstrak 1:10 g/mL) atau larutan asam galat (senyawa fenolat standar) dicampur dengan pereaksi Folin-Ciocalteau (5 mL, diencerkan 1:10 dengan air suling) dan larutan natrium karbonat (4 mL, 1 M)
2. Campuran di atas dibiarkan selama 15 menit dan kadar senyawa fenolat total ditentukan dengan mengukur serapan pada 765 nm dengan spektrofotometer UV-Vis.
3. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan asam galat dengan konsentrasi 0; 50; 100; 150; 200; 250 mg/L dalam metanol:air (1:1)
4. Kadar senyawa fenolat total dinyatakan sebagai setara asam galat (mg/g massa kering atau segar)
3.3.6 Penentuan aktivitas antioksidan
Aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan obat ditentukan dengan metode DPPH yang digunakan oleh Mosquera et al. (2007) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Masing-masing ekstrak encer tumbuhan obat sebanyak 1 mL dicampur dengan 2 mL larutan DPPH (20 mg/L) yang baru dibuat.
2. Masing-masing campuran itu dikocok dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar di tempat gelap
3. Kemudian serapan masing-masing campuran itu diukur pada panjang gelombang 517 nm dengan spektrofotometer UV-Vis
4. Sebagai blanko, digunakan larutan yang dibuat dengan mencampurkan 1 mL metanol-air (1:1) dengan 2 ml larutan DPPH (20 mg/L)
5. Untuk meniadakan serapan ekstrak pada panjang gelombang ini, sampel blanko dibuat dengan mencampurkan 1 ml ekstrak dengan 2 ml metanol-air (1:1).
6. Persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan rumus berikut: % 100 (%) x A A A n Antioksida Aktivitas kontrol ekstrak kontrol
Di sini Akontrol adalah serapan larutan DPPH tanpa ekstrak, Aekstrak adalah serapan ekstrak uji yang sama dengan serapan ekstrak tumbuhan obat + DPPH dikurangi dengan serapan ekstrak blanko tanpa DPPH
7. Nilai IC50 ekstrak tumbuhan obat ditentukan dengan mengukur persentase aktivitas antioksidan larutan ekstrak tumbuhan dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,76 mg/mL melalui analisis regresi linear
3.3.7 Penentuan pola kromatogram kromatografi lapis tipis (KLT) beberapa ekstrak tumbuhan obat
Pola kromatogram kromatografi lapis tipis ekstrak tumbuhan obat ditentukan dengan prosedur yang digunakan oleh Hu et al. (2005) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Larutan ekstrak encer tumbuhan obat dibuat dengan cara yang telah dioptimasi pada percobaan terdahulu, kemudian difraksinasi berturut-turut dengan petroleun eter, kloroform dan metanol untuk memisahkan komponen kimia berdasarkan tingkat kepolarannya, mulai dari yang nonpolar, semipolar sampai polar.
2. Masing-masing fraksi dipekatkan dan kemudian dilarutkan dalam kloroform sampai 50 mL.
3. Plat KLT silica gel 60 F25410 x 10 cm (Merck) dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 30 menit
4. Larutan uji (10 µL) yang berupa larutan fraksi petroleum eter, fraksi kloroform dan fraksi metanol dalam kloroform, larutan zat pembanding dalam kloroform ditotolkan pada plat KLT.
5. Kemudian plat dikembangkan dalam chamber yang dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase gerak
6. Fasa gerak yang digunakan dioptimasi dengan memvariasikan campuran heksana-etilasetat dan campuran petroleum eter-aseton.
7. Setelah fase gerak mencapai 9 cm, plat dikeringkan di udara dan bercak dilihat di bawah sinar ultraviolet (254 nm)
8. Kemudian plat disemprot dengan larutan H2SO4 5 % dalam metanol, dipanaskan pada 110 oC selama 10 menit dan dilihat di bawah sinar ultraviolet.
3.3.8 Penentuan sidik jari fourir transform infra red (FTIR) beberapa ekstrak tumbuhan obat
Sidik jari FTIR ditentukan dengan prosedur yang dipakai oleh Liu et al. (2006) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Larutan ekstrak encer tumbuhan obat dibuat dengan cara yang telah dioptimasi pada percobaan terdahulu, kemudian difraksinasi berturut-turut dengan petroleum eter, kloroform dan metanol.
2. Masing-masing fraksi diuapkan pelarutnya dan dikeringkan-bekukan, kemudian masing-masing sampel sebanyak 2 mg dicampur dengan 100 mg KBr lalu dikempa menjadi pellet.
3. Masing-masing pellet sampel diukur spektrumnya dengan spektrometer FTIR pada bilangan gelombang 400 – 4000 cm-1.
3.3.9 Penentuan pola kromatogram kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) beberapa ekstrak tumbuhan obat
Pola kromatogram KCKT ditentukan dengan prosedur yang dipakai oleh Chaudary et al. (2007) dengan modifikasi sebagai berikut:
1. Larutan ekstrak encer tumbuhan obat dibuat dengan cara yang telah dioptimasi pada percobaan terdahulu (cara refluks dengan campuran metanol-air (70:30) , kemudian difraksinasi berturut-turut dengan heksana, etil asetat, butanol dan air.
2. Masing-masing fraksi diuapkan pelarutnya dan dilarutkan kembali dalam metanol sampai 50 mL, kemudian disaring melalui filter 0,45 µm ke dalam vial kromatografi, kemudian 20 µL larutan ekstrak diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi
3. Sistem kromatografi yang digunakan terdiri dari Shimadzu LC-10ATVP dan SPD-M10AVP detector
4. Pemisahan kromatografi cair dilakukan pada kolom Kromasil-C18 (5 µm, 4,6 x 250 mm) pada suhu kamar
5. Data dikumpulkan dan diolah dengan menggunakan perangkat lunak Shimadzu Class-VP 6.12
6. Pelarut yang digunakan dioptimasi dengan memvariasikan campuran asetonitril-air, metanol-air dan metanol-asam asetat 1% dalam berbagai perbandingan.
7. Laju alir fase mobil adalah 1 mL/menit
9. Larutan rutin, kuersetin dan isokuersetin 1 mg/mL digunakan sebagai sebagai standar pembanding
3.3.10 Isolasi senyawa antioksidan sebagai penanda dalam pengawasan mutu ekstrak daun dewa
Penyiapan sampel bahan tumbuhan
Daun dewa segar sebanyak 1 kilogram, dicuci dengan air sampai bersih lalu dikering-anginkan pada suhu kamar. Pengeringan ini dilakukan sampai daun dewa menjadi kering (kadar air kurang dari 10 %). Setelah kering, daun dewa digiling dengan blender menjadi serbuk kasar.
Ekstraksi dan pengujian daya antioksidan ekstrak
Sebanyak 100 g serbuk daun dewa kering diekstraksi dengan cara refluks berturut dengan n-heksana, kloroform dan metanol. Masing-masing ekstrak diuapkan dengan penguap putar sampai diperoleh ekstrak kental. Masing-masing ekstrak kental diuji daya antioksidannya dengan menggunakan metode DPPH (Mosquera et al., 2009).
Isolasi dan pengujian daya antioksidan isolat
Ekstrak yang mempunyai daya antioksidan yang tinggi diidentifikasi dan diisolasi dengan menggunakan kromatografi kertas dua arah dan kromatografi kertas preparatif. Masing-masing isolat diuji daya antioksidannya dengan menggunakan metode DPPH (Mosquera et al., 2009).
Identifikasi isolat yang aktif sebagai antioksidan
Isolat yang mempunyai daya antioksidan tinggi dimurnikan dengan cara rekristalisasi menggunakan metanol panas. Kemurnian isolat tersebut diuji dengan
KLT pada plat silica F254 dengan fase gerak campuran heksan-etil asetat (7:3) dan noda dilihat di bawah sinar UV 254 dan 366 nm, setelah itu disemprot dengan larutan asam sufat pekat 5% dalam metanol dan nodanya dilihat di bawah sinar tampak. Karakterisasi kimia dari isolat yang aktif sebagai antioksidan dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, LC-MS, 1H-NMR dan
13