METODE Bahan dan Alat - Aplikasi Primer Mikrosatelit pada Proses Seleksi Padi Varietas Code un

Bahan-bahan yang digunakan, antara lain tanaman padi (Code, IR64-NILs-qDTH8 [YP1], dan galur-galur BC₁F₁ Code-qDTH8), medium tanah, nitrogen cair, etanol absolut, etanol 70%, kloroform:isoamilalkohol (24:1), isopropanol dingin, RNase, bufer ekstrak (EDTA 50 mM, tris-HCl 100 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, SDS (Sodium Deodecyl Sulphate) 1.25%, dan NaOH 8.3 mM), agarose, bufer Tris Boric EDTA (TBE) 0.5X, loading buffer (loading dye), larutan TE 1X, DNA ladder 100 bp (Generuler), primer mikrosatelit (RM 20852, RM 20593, RM 5556, RM 6836, dan M5), bufer PCR 1X (10 mM tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin), 100 μM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP), 0.5 μM primer (forward & reverse), 1 unit taq DNA polymerase, dan ddH2O.

Alat-alat yang digunakan, antara lain bak plastik, ember, sumpit, kertas saring, tabung mikro, neraca analitik, sentrifus Beckman Microfuge^TM 12, pipet mikro, pipet volumetrik, penangas air, cetakan gel, sisir, spatula, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, autoklaf, magnetic stirrer, microwave, parafilm, PS500XT DC power supply, alat elektroforesis, UV transilluminator (Chemidoc gel system BIORAD^TM), minivortex BioRad, mesin PCR (PCR BioRad T100^TM Thermal Cycler), dan spektrofotometer nanodrop Thermo Fisher Scientific 2009.

Prosedur Penelitian

Penumbuhan Benih Padi Code, IR64-NILs-qDTH8, dan BC1F1

Penumbuhan benih padi dilakukan pada medium tanah dan diberi pupuk yang sesuai bagi pertumbuhan padi. Benih padi yang ditumbuhkan adalah benih tetua (Code dan IR64-NILs-qDTH8) serta benih hasil backcross (BC1F1). Tetua Code yang ditanam sebanyak empat tanaman, tetua IR64-NILs-qDTH8 yang ditanam sebanyak empat tanaman, dan BC₁F₁ yang ditanam sebanyak 250 tanaman di rumah kaca BB BIOGEN. Setelah tiga minggu, padi dipindahkan ke dalam pot (tiap pot berisi dua tanaman) dan disimpan dalam rumah kaca. Penyiraman, pemupukan, dan pemberian pestisida dilakukan secara berkala hingga tanaman melewati fase generatif.

Isolasi DNA Padi Metode Miniprep (Dellaporta et al. 1983)

Sebanyak 0.5 gram sampel daun padi dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung 2 mL. Tabung dikumpulkan dalam suatu wadah. Nitrogen cair ditambahkan dan dibiarkan selama 5 menit. Tabung mikro diambil dan digerus dengan sumpit hingga menjadi serbuk halus. Tabung yang telah berisi serbuk daun padi tersebut ditambahkan 800 µL bufer ekstrak, lalu diinkubasi pada suhu 65^oC selama 15 menit. Setelah itu, tabung dibolak-balik agar ekstrak tercampur secara merata. Selanjutnya, 800 µL larutan campuran kloroform dan isoamilalkohol dengan perbandingan 24:1 ditambahkan ke dalam tabung, kemudian tabung dibolak-balik kembali hingga larutan tercampur dengan merata. Tabung kemudian disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit.

Supernatan yang terbentuk diambil ± 600 µL dan dipindahkan ke dalam tabung baru. Selanjutnya ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak dua kali volume supernatan yang diambil, tabung dibolak-balik hingga tercampur merata lalu diinkubasi selama ± 1 jam ke dalam freezer (-20 ^oC). Setelah diinkubasi selama ± 1 jam, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan dibuang, sedangkan pelet yang terbentuk ditambahkan 800 µL etanol 70 % lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya, supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh dikeringanginkan selama semalam (overnight). Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 200 μL ddH2O untuk analisis selanjutnya.

Analisis Kualitatif DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook & Russell 2001)

Gel agarosa 0.8 % dan bufer TBE 0.5x disiapkan pada cetakan terlebih dahulu. Larutan dipanaskan ke dalam microwave selama 2-4 menit hingga agar larut. Larutan yang sudah tercampur dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur. Setelah gel agarosa memadat, gel dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi 0.5 x bufer TBE. Sebanyak 1 μL sampel DNA ditambahkan dengan 1 μL loading dye dan dicampur, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Proses running elektroforesis dilakukan dengan voltase 100V selama ± 90 menit. Hasil running elektroforesis selanjutnya divisualisasi dengan UV transiluminator.

Analisis Kuantitatif DNA dengan Spektrofotometer Nanodrop (Thermo Fisher Scientific 2009)

Kuantitas DNA padi diukur dengan menggunakan spektrofotometer Nanodrop. DNA hasil isolasi disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit. Pelet hasil sentrifugasi dilarutkan dengan TE 1X sebanyak 200 μL. Blanko yang digunakan adalah larutan TE 1X. Lubang optik dibersihkan terlebih dahulu. Larutan TE 1X diteteskan sebanyak 2 μL (satu tetes) ke dalam lubang optik dan ditutup. Menu measure blank kemudian dipilih pada komputer. Lubang optik dibersihkan kembali dan dimasukkan dengan sampel sebanyak 2 μL (satu tetes). Hasil pengukuran akan ditampilkan dalam bentuk konsentrasi (ng/μL) dan kemurnian DNA berdasarkan rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. DNA dengan nilai kemurnian yang baik berada pada rentang 1.8 hingga 2.0.

Analisis SSR (Fujita et al. 2012)

Campuran larutan PCR dibuat dengan mencampurkan 3 μL DNA (50 ng/ µL) dan PCR MIX yang mengandung 2 µL 10x bufer PCR, 0.2 µL dNTPs 10 µM, 0.2 µL MgCl₂, 0.5 µL GC-Rich, 1 µL primer reverse dan forward 5 µM (RM 5556, RM 6836, dan RM20582 [Xa7]), 0.12 µL Taq DNA polimerase dan ditambahkan ddH2O hingga volume mencapai 10 µL. Campuran DNA dimasukkan ke dalam plate dan kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. Program PCR yang digunakan adalah denaturasi awal selama 5 menit pada suhu 94ôC, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri atas: denaturasi (denaturation) selama 60 detik pada suhu 94ôC, penempelan primer (annealing) selama 60 detik pada suhu 55ôC, dan perpanjangan primer (extension) selama 2 menit pada suhu 72ôC. Perpanjangan primer terakhir dilakukan selama 7 menit pada suhu 72ôC.

Elektroforesis Hasil PCR (Sambrook et al. 1989)

Analisis hasil PCR menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida (PAGE) diawali dengan menyiapkan rangkaian alat elektroforesis terlebih dahulu. Plat kaca dibersihkan dengan alkohol dan dibiarkan hingga kering. Kaca yang telah kering lalu digabungkan yaitu antara kaca A dan kaca B. Gel poliakrilamid dibuat dengan mencampurkan larutan PAGE yaitu 8% poliakrilamid sebanyak 800 ml, APS (Ammonium Persulfat) 10% sebanyak 800 µL dan TEMED (tetrametilen-etilendiamin) sebanyak 80 µL. Campuran diaduk hingga merata lalu dituangkan ke dalam cetakan kaca yang telah dirangkai terlebih dahulu dengan cepat. Gel didiamkan memadat selama 60 menit.

Gel poliakrilamid yang telah memadat pada cetakan kaca dimasukan ke dalam tangki elektroforesis horizontal dan ditambahkan bufer TBE 0.5x ke dalamnya. Setelah gel siap, produk PCR yang telah ditambahkan 4µL loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel sebanyak 4 µL dan disertakan DNA marker 100 bp ladder sebanyak 3 µL sebagai pembanding pada sumur pertama untuk melihat ukuran DNA. Selanjutnya sampel DNA dialiri arus listrik dengan daya 100 volt selama 90 menit. Gel poliakrilamid yang telah selesai running dicuci dengan dH₂O dan diwarnai dengan etidium bromida. Gel poliakrilamid kemudian didokumentasi dengan alat gel doc Biorad.

Analisis Data

Data molekuler yang diperoleh dari pita-pita DNA hasil elektroforesis dianalisis dengan melihat posisi pita dalam elektroforegram dan digunakan sebagai penentu seleksi tanaman BC₁F₁. Data agronomi yang meliputi data tinggi tanaman, jumlah anakan, jumlah anakan produktif, umur berbunga, panjang malai, jumlah gabah isi, jumlah gabah hampa, berat 100 butir gabah, dan berat gabah total dianalisis menggunakan program Microsoft Excel dan program statistik SAS.

HASIL

Kualitas dan Kuantitas DNA Padi BC1F1 Code-qDTH8

Hasil uji kualitas DNA padi hasil isolasi yang diambil secara acak menunjukkan pita-pita yang cukup tebal (Gambar 1). Elektrogram juga

PENDAHULUAN

Padi varietas Code merupakan kelompok padi sawah varietas unggul tahan penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang merupakan hasil persilangan IR64 dan IRBB7. Padi Code memiliki gen Xa7 yang terkait dengan ketahanan beberapa strain Xanthomonas oryzae pv oryzae, seperti strain II, IV, dan VIII. Padi Code juga diketahui memiliki ketahanan terhadap wereng coklat biotipe 1, 2, dan agak tahan terhadap biotipe 3. Karakteristik lain dari padi Code adalah umur tanaman 115-125 hari, dapat menghasilkan anakan sekitar 16-24 batang, tinggi tanaman sekitar 97-103 cm dan hasil panen sekitar 5.4 ton/ha (Leung et al. 2004; Suprihatno et al. 2009). Meskipun padi varietas Code memiliki sifat unggul tahan terhadap HDB, perbaikan varietas padi Code tetap perlu dilakukan untuk memenuhi kebutuhan pangan nasional yang terus meningkat dan menghadapi fenomena perubahan iklim yang terjadi. Salah satu langkah pengembangan yang dapat dilakukan untuk menghadapi perubahan iklim, yaitu dengan cara penyisipan gen pengatur umur berbunga (Days to Heading). Salah satu gen pengatur umur berbunga yang cukup dikenal adalah qDTH8, yaitu gen penyandi umur berbunga yang terletak pada kromosom 8 (Zhang et al. 2006; Fujita et al. 2010).

Proses seleksi varietas padi dapat dilakukan dengan metode konvensional dan dengan metode marka molekuler. Pengembangan varietas secara konvensional dapat dilakukan dengan cara melakukan proses seleksi fenotipe atau morfologi terhadap tanaman yang memiliki suatu sifat unggul dan kemudian disilangkan. Metode ini memiliki beberapa kelemahan, yaitu hasil persilangan yang tidak konsisten dan waktu persilangan yang cukup lama (Nuraida 2012). Metode marka molekuler kemudian dirancang untuk mengatasi kelemahan dari metode konvensional. Metode marka molekuler memanfaatkan suatu sifat unggul yang dapat diwariskan oleh tanaman sehingga sifat tersebut dapat dimiliki oleh keturunan selanjutnya. Proses identifikasi sifat itu sendiri dilakukan dengan menggunakan marka DNA sehingga varietas yang dihasilkan lebih konsisten dan lebih akurat (Azrai 2006).

Marka DNA merupakan marka pengembangan dari marka isozim yang memiliki beberapa kelebihan, seperti kemampuan untuk melingkupi seluruh genom tanaman, jumlahnya tidak terbatas, tidak dipengaruhi oleh regulasi perkembangan jaringan, dan memiliki kemampuan tinggi untuk menangkap keragaman karakter antarindividu (Nuraida 2012). Penggolongan marka DNA dengan menggunakan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) dapat dibagi ke dalam tiga golongan, yaitu marka berdasarkan hibridisasi DNA (Restriction Fragment Length Polymorphism [RFLP]), marka berdasarkan pada reaksi rantai polimerase PCR secara acak (Random Amplified Polymorphic DNA [RAPD] dan Amplified Fragment Length Polymorphism [AFLP]), dan marka berdasarkan pada PCR yang menggunakan primer terarah (Sequence Tagged Sites [STS], Sequence Characterized Amplified Regions [SCARs], Simple Sequence Repeats [SSR] atau mikrosatelit, dan Single Nucleotide Polymorphism [SNPs]) (Azrai 2005).

Penelitian ini menggunakan padi varietas Code sebagai tetua pemulih dan IR64-NILs-qDTH8 [YP1] sebagai tetua donor untuk menghasilkan suatu varietas Code dengan umur berbunga yang lebih singkat. Hasil persilangan tersebut menghasilkan benih F1 Code-qDTH8 yang salah satu kromosomnya membawa sifat umur berbunga yang singkat. Padi F1 Code-qDTH8 selanjutnya

disilangbalikkan (backcross) dengan Code sehingga menghasilkan tanaman padi BC1F1 yang mengandung gen Xa7 dan qDTH8.

Proses seleksi terhadap padi galur BC1F1 secara molekuler dengan primer mikrosatelit masih belum dilakukan. Selain itu, analisis karakter agronomi padi Code masih belum banyak diketahui. Penelitian ini bertujuan menyeleksi galur padi BC1F1 Code-qDTH8 yang dilakukan dengan menggunakan metode analisis molekuler PCR berbasis primer mikrosatelit atau SSR (Simple Sequence Repeat) dan analisis karakter agronomi padi BC₁F₁ Code-qDTH8. Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya galur BC1F1 Code x IR64-NILs-qDTH8 [YP1] dengan umur berbunga yang lebih singkat dibandingkan dengan galur Code. Penelitian ini juga akan mempermudah proses pemilihan genotipe untuk menghasilkan keturunan BC2F1 dan BC1F2.

METODE

Bahan dan Alat

Prosedur Penelitian

Penumbuhan Benih Padi Code, IR64-NILs-qDTH8, dan BC1F1

SIMPULAN DAN SARAN

Seleksi galur BC₁F₁ hasil persilangan Code dan IR64-NILs-qDTH8 [YP1] berhasil dilakukan dengan menggunakan tiga primer mikrosatelit (SSR), yaitu primer RM20582 untuk gen ketahanan Xa7 serta primer RM5556 dan RM6838 untuk gen penyandi umur berbunga qDTH8. Terjadi pemendekan umur berbunga galur BC1F1 dibandingkan dengan umur berbunga tetua Code sebesar 14 hari. Pemendekan umur berbunga pada galur BC1F1 juga menyebabkan peristiwa penurunan tinggi tanaman dan penurunan berat gabah 100 butir yang tidak terlalu signifikan. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dalam proses seleksi tanaman padi pada generasi selanjutnya dan menentukan karakteristik gen penyandi umur berbunga lainnya, selain gen qDTH8.

DAFTAR PUSTAKA

Aliyu RE, Wasiu AA, Dangora DB, Ademola JO, Adamu AK. 2013. Comparative study of genomic DNA extraction protocols in rice species. International Journal of Advancements in Research & Technology. 2(2):1-3.

Azrai M. 2006. Sinergi teknologi marka molekuler dalam pemuliaan tanaman jagung. Jurnal Litbang Pertanian. 25(3):81-89.

Azrai M. 2005. Pemanfaatan marka molekuler dalam proses seleksi pemuliaan tanaman. Jurnal AgroBiogen. 1(1):26-37.

Collard BC, Mackill DJ. 2007. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty first century. Phil Trans R Soc B. 363:557-572. (doi: 10.1098/rstb.2007.2170)

Corbesier L, Coupland G. 2006. The quest for florigen: a review of recent progress. Journal of Experimental Botany. 57(13):3395-3403.

Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. 1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep. 1(4):19-21.

Fujita D, Tagle AG, Ebron LA, Fukuta Y, Kobayashi N. 2012. Characterization of near-isogenic lines carrying QTL for high spikelet number with the genetic background of an indica rice variety IR64 (Oryza sativa L). Breeding Science. 62:18-26.

Fujita D, Santos REM, Ebron LA, Yanoria MJT, Kato H, Kobayashi S, Uga Y, Araki E, Takai T, Tsunematsu H, et al. 2010. Characterization of introgression lines for yield-related traits with indica-type rice variety IR64 genetic background. JARQ. 44(3):277-290.

Leung H, Wu J, Liu B, Bustaman M, Sridhar R, Singh K, Redona E, Quang VD, Zheng K, Bernardo M, Wang G, Leach J, Choi IR, Cruz CV. 2004. Sustainable disease resistance in rice: Current and future strategies. New directions for a diverse planet. Proceedings of the 4^th International Crop Science Congress; 2004 Sep 26- Okt 1; Brisbane, Australia. Gosford (AUS): The Regional Institute Ltd. hlm 1-10.

Ma J, Ma W, Ming D, Yang S, Zhu Q. 2006. Characteristics of rice plant with heavy panicle. Agri Sci. 5 (12):101-105.

Miah G, Rafii MY, Ismail MR, Puteh AB, Rahim HA, Islam KH, Latif MA. 2013. A review of microsatellite markers and their application in rice breeding programs to improve blast disease resistance. Int J Mol Sci. 14:22499-22528.

Naeem M, Iqbal M, Khan MA, Nazeer W, Rizwan M, Ijaz M. 2013. Importance of QTL mapping for heading date in rice. World Applied Sciences Journal. 22(7):1001-1006.

Nuraida D. 2012. Pemuliaan tanaman cepat dan tepat melalui pendekatan marka molekuler. El-Hayah. 2(2):97-103.

Peng S, Khush GS, Virk P, Tang Q, Zou Y. 2008. Progress in ideotype breeding in increase rice yield potential. Field Crop Res. 108:32-38.

Ranawake AL, Amarasinghe UGS. 2014. Trait effect in different days to flowering groups of rice cultivars as described by path analysis. International Journal of Scientific and Research Publications. 4(7):1-9. Sambrook J, DW Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Edisi

3. New York (GB): Coldspring Harbor Laboratory Press.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Ed ke-1. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory.

Suprihatno B, Daradjat AA, Satoto, Baehaki SE, Widiarta IN, Setyono A, Indrasari SD, Lesmana OS, Sembiring H. 2009. Deskripsi Varietas Padi. Subang(ID): Balai Besar Penelitian Tanaman Padi.

Susanto U, Aswidinnoor H, Koswara J, Setiawan A, Lopena V, Torizo L, Parminder VS. 2008. QTL mapping of yield, yield components, and morphological traits in rice (Oryza sativa L.) using SSR marker. Bul. Agron. 36(3):188-195.

Takeuchi Y. 2011. Developing isogenic lines of Japanese rice cultivar ‘Koshihikari’ with early and late heading. JARQ. 45(1):15-22.

Tan H, Tie M, Zhang L, ZhuY, Li H. 2013. The effects of three different grinding methods in DNA extraction of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp). African Journal of Biotechnology. 12(16):1946-1951.

Taoka K, Ohki I, Tsuji H, Furuita K, Hayashi K, Yanase T, Yamaguchi M, Nakashima C, Purwestri YA, Tamaki S, et al. 2011. 14-3-3 proteins act as intracellular receptors for rice Hd3a florigen. Nature. 476:332-338.

Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrophotometer V1.0 User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific.

Xiang C, Qu L, Gao Y, Shi Y. 2013. Flower development and photoperiodic control of flowering in rice. Rice Science. 20(2):79-87.

Yan WH, Wang P, Chen HX, Zhou HJ, Li QP, Wang CR, Ding ZH, Zhanf YS, Yu SB, Xing YZ, Zhang QF. 2010. A major QTL, Ghd8, plays pleiotropic roles in regulating grain productivity, plant height, and heading date in rice. Molecular Plant. 4(2):319-330.

Yano M, Kojima S, Takahashi Y, Lin HX, Sasaki T. 2001. Genetic control of flowering time in rice, a short-day plant. Plant Physiology. 127:1425-1429. Zhang Y, Luo L, Xu C, Zhang Q, Xing Y. 2006. Quantitative trait loci for panicle

size, heading date and plant height co-segregating in trait-performance derived near-isogenic lines of rice (Orzya sativa). Theo Appl Genet. 113:361-368.

Dalam dokumen Aplikasi Primer Mikrosatelit pada Proses Seleksi Padi Varietas Code untuk Sifat Umur Berbunga (Halaman 60-67)