Pengujian TBIA. Pengujian TBIAdilakukan berdasarkan metode Lin et al. (1990). Sampel daun dipotong melintang pada bagian pangkal daun yang masih putih dan dibuat tepi potongan yang rata. Potongan ini kemudian ditempelkan pada membran nitroselulosa (Amersham Hybond-P PVDF membrane, GE Health Care, UK) selama 1 menit. Sebelumnya membran diperlakukan dengan dicelup pada metanol absolut selama 10 detik, kemudian dicuci masing-masing 5 menit di dalam akuabides dan phosphate buffer saline
(PBS) (137 mM NaCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,0 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 3,0
mM NaN3, pH 7,4) dan dikeringanginkan di atas kertas saring yang telah dicelup
ke dalam PBS. Membran yang telah diblot ditempatkan dalam wadah plastik dan diblocking dengan susu skim 2% (w/v) yang dilarutkan dalam PBS selama 60 menit pada suhu ruang. Membran diinkubasikan dengan antiserum pada suhu ruang selama 1-2 jam, atau pada suhu 4°C semalam. Antiserum diencerkan dalam PBS dengan seri pengenceran sesuai perlakuan. Membran dicuci dengan PBST
selama 10 menit sebanyak 3 kali pada suhu ruang. Membran kemudian diinkubasikan dengan konjugat anti guinea pig-IgG (Sigma Chemical Co. St. Louise, USA) pada pengenceran 1:1000 dalam PBS selama 2-3 jam pada suhu ruang. Membran dicuci sebagaimana di atas, dan diwarnai dengan substrat 5- bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT) (Sigma Chemical Co., USA) dalam bufer alkaline phosphate (AP) (0,1 M Tris Base, 0,1 M NaCl, 5,0 mM MgCl2.6H2O, pH 9,5). Reaksi positif ditunjukkan dengan
perubahan warna ungu pada tissue blot. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan mencuci membran dengan akuabides dan dikeringanginkan.
Analisis Western blot. Analisis Western blot menggunakan antiserum yang diproduksi, dilakukan berdasarkan metode Towbin et al. (1979) seperti diuraikan pada halaman 28.
ISEM. Teknik ISEM dilakukan berdasarkan metode Dykstra (1992). Satu tetes suspensi antiserum diteteskan pada cawan Petri yang sudah dilapisi membran parafilm. Grid yang sudah dilapisi colodion dan dikarbonisasi diletakkan secara perlahan pada tetesan suspensi antiserum. Bagian grid yang terlapisi dibuat menempel pada suspensi dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 25oC. Grid
dicuci dengan sepuluh tetes PBS. Siapan virus murni diteteskan pada bagian lain di atas parafilm dan grid diletakan pada tetesan siapan virus murni tersebut, kemudian diinkubasikan selama 15 menit. Grid dicuci sebagaimana pencucian sebelumnya. Grid dikeringkan, dan segera setelah itu bagian grid yang terlapisi diletakkan pada cairan pewarna. Grid dikeringkan dengan kertas saring dan diamati dengan mikroskop elektron transmisi model JEOL 1010 yang dioperasikan pada 80 kV. Siapan virus murni tanpa didekorasi dengan antiserum dipakai sebagai kontrol.
Karakter Chrysanthemum B Carlavirus (CVB)
Gejala CVB pada Tanaman Krisan dan Kejadian Penyakit
Beberapa jenis gejala yang ditemukan di berbagai lokasi pertanaman krisan di Brastagi (Medan); Cibadak dan Cipanas (Cianjur); Kota Batu dan Pujon (Malang); Baturiti dan Pancasari (Bali) adalah gejala belang ringan; mosaik ringan; pemucatan tulang daun; penebalan tulang daun, malformasi (daun lebih kecil, lebih tebal dan menggulung ke atas); dan pecah warna pada bunga (Gambar 6).
Gambar 6. Gejala infeksi CVB pada tanaman krisan. A : mosaik ringan dan malformasi pada daun. B : penebalan tulang daun. C : pecah warna bunga. D : tanaman sehat.
Gejala-gejala tersebut sesuai dengan deskripsi infeksi CVB yang telah dilaporkan sebelumnya. Infeksi CVB pada tanaman krisan dapat menimbulkan variasi gejala pada daun seperti penebalan tulang daun, mosaik, belang, dan pemucatan tulang daun yang sangat ringan. Pada bunga dapat mengakibatkan
A
A B
penurunan kualitas bunga yaitu warna mahkota bunga terputus-putus (pecah warna), garis nekrotik dan kadang-kadang mengalami malformasi (Hollings & Stones, 1972; Verma et al. 2003); tetapi sering tanaman krisan yang terinfeksi virus ini tidak menunjukkan gejala (symptomless) (Hollings & Stone, 1972).
Berdasarkan ekspresi gejala, yang kemudian diverifikasi dengan ELISA, CVB ditemukan pada 5 lokasi dari 7 lokasi survei yaitu Brastagi, Cibadak, Cipanas, Kota Batu dan Pancasari. Deteksi CVB menggunakan metode ELISA terhadap 287 sampel bergejala yang dikumpulkan dari lokasi survei menunjukkan bahwa sebanyak 34,84% terinfeksi oleh CVB. Frekuensi infeksi CVB tertinggi ditemukan di Cipanas dan terendah di Cibadak yaitu masing-masing 67,44% dan 7,50%, sedangkan di Pujon dan Baturiti tidak ditemukan CVB menginfeksi tanaman krisan (Tabel 1).
Tabel 1. Frekuensi infeksi CVB pada sampel tanaman krisan dari sentra produksi krisan di Indonesia
No. Lokasi pengambilan sampel
Frekuensi infeksi*
Gejala** Varietas
1 Sumatera Utara
a. Brastagi, Karo 62,22% (27/45***) ttd, ma, pw Fuji white 2 Jawa Barat
a. Cibadak, Cianjur 7,50% (3/40) br, ma Pingpong b. Cipanas, Cianjur 67,44% (29/43) ptd, ma, pw Stalion yellow 3 Jawa Timur
a. Kota Batu, Malang 43,18% (19/44) ttd, mr, ma, pw Lilac Elionora b. Pujon, Malang 0% (0/45) mr, br Puma Sunny 4 Bali
a. Baturiti, Tabanan 0% (0/42) mr, ma Pingpong b. Pancasari, Buleleng 52,50% (21/40) mr, ttd, ma, pw Lilac Elionora
*
Verifikasi infeksi berdasarkan ELISA
**
ptd: pemucatan tulang daun br: belangringan ma: malformasi ttd: penebalan tulang daun pw: pecah warna mr: mosaikringan
***
a/b : a sampel menunjukkan positif terinfeksi dari b sampel yang diuji
Hasil survei ini menunjukkan telah terjadi infeksi CVB yang cukup meluas, yang sebelumnya belum pernah dilaporkan adanya infeksi CVB pada tanaman krisan di Indonesia. Survei di Pujon dan Baturiti tidak menemukan infeksi CVB, walaupun hasil pengamatan menemukan gejala yang mirip akibat infeksi CVB yaitu mosaik ringan, belang ringan dan malformasi daun. Berdasarkan hasil ELISA, ternyata gejala tersebut berasosiasi dengan infeksi
CMV pada beberapa sampel dari kedua daerah tersebut (Tabel 2). Hal ini tidaklah mengherankan karena selain CVB, krisan juga dapat diinfeksi oleh CMV dan virus lain seperti TAV dan TSWV (Bouween & Zaayen, 1995);TuMV (Chen et al. 2000); dan TMV, PVY, dan PVX (Navalinskiene & Samuitiene, 1996). Di samping virus, viroid yaitu CChMVd dan CSVd juga dapat menginfeksi krisan. CChMVd diketahui hanya terdapat di Amerika Serikat dan Jepang dan infeksinya pada pertanaman krisan terbatas pada areal relatif kecil (Randles, 2004; Flores et. al., 2004), sedangkan CSVd tercatat di Asia yaitu di China, India dan Jepang, dengan variasi gejala yang ditimbulkan seperti pertumbuhan tanaman menjadi terhambat (stunting), daun berukuran kecil (malformasi) dan berwarna hijau pucat (Diener & Lawson, 1973; Randles, 2004).
Frekuensi infeksi CVB berkisar antara 7,50% sampai 67,44%. Proporsi kejadian penyakit atau tingkat serangan virus tersebut ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya cara bercocok tanam dan varietas krisan yang ditanam. Teknik bercocok tanam krisan sangat membantu penyebaran CVB yang bersifat sistemik. Pembibitan dengan stek pucuk, pemangkasan pucuk pada saat pembibitan, pembuangan mata tunas dan penyiangan merupakan kegiatan yang sering mengakibatkan berpindahnya virus dari satu tanaman ke tanaman lain. Hull (2002) menyatakan bahwa praktek bertani melalui perbanyakan dengan stek dan umbi menyebabkan virus yang sistemik mudah ditularkan dan disebarkan ke tempat lain yang jauh. Pada umumnya varietas krisan yang diusahakan di Indonesia rentan terhadap infeksi CVB. Dilihat dari frekuensi infeksi nampaknya varietas-varietas krisan Stalion yellow, Fuji white dan Lilac Elionora cukup rentan terhadap infeksi CVB; sedangkan varietas Pingpong dan Puma Sunny kemungkinan termasuk varietas tahan. Varietas Pingpong yang ditanam di Cibadak hanya terinfeksi 7,50%, bahkan tidak terjadi infeksi pada varietas Pingpong di Baturiti; demikian pula dengan varietas Puma Sunny yang ditanam di Pujon. Penemuan Verma et al. (2003) yang menggunakan 36 kultivar krisan, hanya menemukan tujuh kultivar yang memberikan reaksi negatif terhadap CVB, yaitu kultivar Bronze Mundiyal, Otome Zakura, Thiching Queen, Jyoti, Lilith, Megami dan Meghdoot.
Reaksi Virus terhadap Berbagai Antiserum
Uji serologi dengan metode ELISA dilakukan untuk mengetahui reaksi sampel terhadap berbagai antiserum (CVB, TSWV, CMV, PVY dan TMV). Lebih dari 50% sampel tanaman berasal dari Brastagi, Cipanas dan Pancasari menunjukkan reaksi positif terhadap CVB, sedangkan sampel tanaman yang berasal dari lokasi lain (Cibadak dan Kota Batu) hanya menunjukkan reaksi positif kurang dari 50%. Uji serologi ini menemukan bahwa ternyata sampel tanaman tersebut diinfeksi oleh CVB secara tunggal (Tabel 2). Sampel dari Pujon dan Baturiti tidak menunjukkan reaksi positif terhadap antiserum CVB, tetapi beberapa sampel menunjukkan reaksi positif terhadap antiserum CMV. Sampel- sampel pada penelitian ini menunjukkan nilai absorbansi yang bervariasi pada panjang gelombang 405 nm (Lampiran 1). Sampel yang menunjukkan reaksi positif terhadap antiserum CVB memiliki nilai absorbansi pada panjang gelombang 405 nm antara 6,3 – 7,7 kali nilai absorbansi pada kontrol negatif, sedangkan sampel positif terhadap antiserum CMV nilai absorbansinya 2,1 – 3,2 kali kontrol negatif.
Tabel 2. Frekuensi infeksi virus pada sampel tanaman krisan bergejala dari berbagai lokasi berdasarkan ELISA
No Lokasi pengambilan sampel Antiserum CVB TSWV CMV PVY TMV 1 Brastagi 28/45* 0/45 0/45 0/45 0/45 2 Cibadak 3/40 0/40 0/40 0/40 0/40 3 Cipanas 29/43 0/43 0/43 0/43 0/43 4 Kota Batu 19/44 0/44 0/44 0/44 0/44 5 Pujon 0/45 0/45 4/45 0/45 0/45 6 Baturiti 0/42 0/42 3/42 0/42 0/42 7 Pancasari 21/40 0/40 0/40 0/40 0/40 *
a/b : a sampel menunjukkan positif terinfeksi dari b sampel yang diuji
CVB yang diisolasi dari tanaman krisan asal Cipanas, Cianjur, Jawa Barat dipakai untuk penelitian selanjutnya, dan dinamakan CVB-Ina.
Respon Tanaman Indikator terhadap Infeksi CVB
CVB-Ina menginfeksi hanya 7 spesies tanaman dari 26 spesies tanaman yang digunakan dalam uji kisaran inang (Tabel 3). CVB hanya menginfeksi tanaman dari famili solanaceae dan chenopodiaceae, tetapi tidak menginfeksi spesies-spesies dari famili leguminosae, cucurbitaceae, cruciferae dan amaranthaceae.
Gejala lesio lokal klorotik atau nekrotik tanpa gejala sistemik ditemukan pada tanaman C. amaranticolor dan C. quinoa, sedangkan lesio lokal disertai gejala sistemik (penebalan tulang daun dan mengerut) ditemukan pada tanaman
P. hybrida. Gejala infeksi sistemik tanpa menunjukkan gejala lokal terjadi pada tanaman N. benthamiana dan N. tabacum var. Havana yang menunjukkan gejala pemucatan tulang daun dan belang ringan; pada tanaman N. clevelandii
menunjukkan tepi daun menggulung dan belang ringan; dan pada tanaman N. tabacum var. White Burley menunjukkan gejala pemucatan tulang daun (Gambar 7).
Tabel 3. Respon berbagai tanaman indikator terhadap infeksi CVB-Ina
Famili dan spesies tanaman Frekuensi infeksi* Variasi gejala**
Solanaceae Tomat (Lycopersicon esculentum ) 0/10*** tb
Kecubung (Datura stramonium ) 0/10 tb Cabai rawit (Capsicum frutescens ) 0/10 tb Cabai besar (C. annuum ) 0/10 tb Terong (Solanum melongena ) 0/10 tb
Nicotiana benthamiana 10/10 ptd, br
N. clevelandii 10/10 br, ma
N. glutinosa 0/10 tb
N. tabacum var. White Burley 6/10 ptd
N. tabacum var. Xanthi 0/10 tb
N. tabacum var. Havana 10/10 ptd, br
Petunia hybrida 10/10 ll, ttd
Leguminosae Kedelai (Glycine max) 0/10 tb Kacang panjang (Vigna
unguiculata)
0/10 tb
Kacang hijau (V. radiatus) 0/10 tb Kacang tanah ( Arachis hypogaea) 0/10 tb
Cucurbitaceae Mentimun (Cucumis sativus ) 0/10 tb
Semangka (Citrulus radiatus) 0/10 tb Labu (Cucurbita moschata) 0/10 tb Melon (Cucumis melo) 0/10 tb Chenopodiaceae
Chenopodium amaranticolor 10/10 ll
C. quinoa 10/10 ll
Cruciferae Kubis (Brassica oleracea) 0/10 tb Sawi hijau (B. juncea) 0/10 tb Caisin (B. campestris) 0/10 tb Amaranthaceae
Gomphrena globosa 0/10 tb
*
Verifikasi infeksi berdasarkan ELISA
**
ptd : pemucatan tulang daun; br: belangringan; ttd : penebalan tulang daun; ll : lesio lokal; ma: malformasi; tb : tidak bergejala
***
Gambar 7. Variasi gejala CVB pada beberapa tanaman. A : pemucatan tulang daun pada N. benthamiana. B : tepi daun menggulung dan belang ringan pada N. clevelandi. C : penebalan tulang daun dan mengerut pada P. hybrida. D : lesio lokal pada C. quinoa.
Identifikasi Kutudaun
Hasil identifikasi menggunakan kunci determinasi Blackman & Eastop (2000) menunjukkan bahwa kutudaun yang digunakan untuk penularan CVB yang berasal dari tanaman krisan adalah Macrosiphonoiella sanborni
Gillette (Homoptera : Aphididae). Kutudaun ini ditemukan mengkoloni tanaman krisan di Cibadak kabupaten Cianjur (Jawa Barat). Kutudaun membentuk koloni di permukaan bawah daun muda dan tangkai pucuk. Kutudaun di lapangan umumnya ditemukan pada bagian atas tanaman atau yang jauh dari permukaan tanah (Gambar 8A).
M. sanborni berwarna coklat kemerahan sampai coklat kehitaman, dan permukaan kulit mengkilap (Gambar 8B). Berdasarkan hasil identifikasi pada preparat awetan pada mikroskop, M. sanborni memiliki panjang tubuh 1,5-1,8 mm; bentuk kepala berkembang sempurna; sifunkuli dan kauda berwarna gelap, sifunkuli sedikit lebih pendek daripada kauda (Gambar 8C, 9). M. sanborni
memiliki bentuk kepala, kauda dan sifunkuli yang berbeda dengan kutudaun
A B
lainnya yang juga menyerang tanaman krisan seperti Brachycaudus helichrysi
Kaltenbach, Aphis gossypii Glover dan Coloradoa rufomaculata Wilson. Bentuk kepala M. sanborni berkembang sempurna, sedangkan B. helichrysi, A. gossypii
dan C. rufomaculata memiliki bentuk kepala yang tidak berkembang (Gambar 10). M. sanborni memiliki kauda berbentuk lidah, panjangnya lebih panjang dibandingkan dengan lebar pangkalnya; sedangkan kauda B. helichrysi
berbentuk helm dan panjangnya lebih pendek dibandingkan dengan lebar pangkalnya; kauda A. gossypii agak mengecil pada bagian tengah; dan kauda C. rufomaculata berbentuk kerucut (Gambar 11). Kutudaun M. sanborni, B. helichrysi, A. gossypii dan C. rufomaculata memiliki sifunkuli silindris. Sifunkuli M. sanborni dan B. helichrysi meruncing ke arah ujung, tetapi sifunkuli
B. helichrysi memiliki bibir pada ujungnya. Sifunkuli A. gossypii meruncing dari pangkal sampai bagian tengah dan hampir lurus dari bagian tengah sampai ke ujung, sedangkan sifunkuli C. rufomaculata membengkak didekat ujung dengan bibir pada bagian ujungnya (Blackman & Eastop, 2000; Cottier, 1953) (Gambar 12).
Gambar 8. Imago kutudaun M. sanborni. A dan B : koloni kutudaun pada tangkai pucuk tanaman krisan. C : preparat mikroskopi M. sanborni
Gambar 9. Gambar mikroskopi kutudaun yang dapat menyerang krisan.
M. sanborni (A), B. helichrysi (B), A. gossypii (C), dan C. rufomaculata (D). (Sumber: Blackman & Eastop, 2000)
Gambar 10. Bentuk kepala M. sanborni berkembang sempurna (A), dan bentuk kepala B. helichrysi (B), A. gossypii (C) dan C. rufomaculata (D) yang tidak berkembang. (Sumber : Cottier, 1953)
Gambar 11. Kauda M. sanborni berbentuk lidah (A), kauda B. helichrysi
berbentuk helm (B), kauda A. gossypii agak mengecil pada bagian tengah (C), dan kauda C. rufomaculata berbentuk kerucut (D). (Sumber : Cottier, 1953)
A B C D
A B C
D
Gambar 12. Sifunkuli M. sanborni meruncing ke arah ujung (A), sifunkuli B. helichrysi meruncing dengan bibir pada ujungnya (B), sifunkuli A. gossypii meruncing dari pangkal sampai bagian tengah dan hampir lurus dari bagian tengah sampai ke ujung (C), dan sifunkuli C. rufomaculata membengkak didekat ujung dengan bibir pada bagian ujungnya (D). (Sumber : Cottier, 1953)
Efisiensi Penularan CVB oleh Kutudaun
Hasil pengujian penularan CVB melalui kutudaun M. sanborni
menunjukkan bahwa 14 individu kutudaun setiap tanaman mampu menularkan CVB-Ina dengan frekuensi infeksi 12,5% dari tanaman terinfeksi ke tanaman sehat (Tabel 4). Frekuensi infeksi meningkat menjadi 62,5% pada penularan menggunakan 21 individu kutudaun setiap tanaman. Efesiensi penularan CVB-Ina oleh kutudaun lebih tinggi dibandingkan dengan efisiensi penularan CVB isolat Jepang (CVB-S). Penularan CVB-S dengan 14 individu kutudaun setiap tanaman belum mengakibatkan infeksi, sedangkan penularan dengan 21 individu kutudaun mengakibatkan frekuensi infeksi hanya 12,5%.
Tabel 4. Hasil penularan CVB melalui kutudaun M. sanborni
Jumlah kutudaun/tanaman Frekuensi infeksi* CVB-Ina CVB-S 1 0% (0/8**) 0% (0/8) 7 0% (0/8) 0% (0/8) 14 12,5% (1/8) 0% (0/8) 21 62,5% (5/8) 12,5% (1/8) *
Verifikasi infeksi berdasarkan ELISA
**
a/b : a sampel menunjukkan positif terinfeksi dari b sampel yang diuji A B C D
Karakteristik Virus Murni
Pemurnian CVB menggunakan metode pemisahan virus dengan cara ultrasentrifugasi dengan gradien kepekatan sesium sulfat berhasil memperoleh zona virus yang membentuk suatu pita yang berbatas tegas yang mencerminkan lokasi virus berada (Gambar 13).
Spektrofotometri terhadap suspensi virus murni pada panjang gelombang 260 nm (A260) dan 280 nm (A280) menghasilkan nilai absorbansi berturut-turut
1,449 dan 1,183 (Gambar 14). Tingkat kemurnian virus dapat dihitung dari nisbah A260/A280 yaitu 1,22. Nilai nisbah ini menunjukkan suspensi virus murni hasil
purifikasi pada penelitan ini mempunyai tingkat kemurnian yang cukup tinggi. Dijkstra & de Jager (1998) menyatakan bahwa virus dengan bentuk partikel memanjang memiliki nilai A260/A280 sekitar 1,2; sedangkan virus dengan partikel
berbentuk isometrik memiliki nilai A260/A280 sekitar 1,7.
Gambar 13. Hasil pemurnian virus dengan pemisahan virus melalui ultrasenrifugasi dengan gradien kepekatan sesium sulfat. Zona virus murni membentuk pita yang berbatas tegas.
Gambar 14. Profil spektrofotometri siapan virus murni
Berdasarkan asumsi bahwa extinction coefficient (E10.cm1%.260nm) carlavirus
adalah 2,3 (Koenig, 1982), maka konsentrasi virus pada suspensi virus murni tersebut adalah 0,630 mg/ml. Dengan demikian total virus yang dihasilkan dari 200 g daun segar N. benthamiana adalah 6,250 mg.
Hasil pemurnian CVB telah dilaporkan oleh beberapa peneliti sebelumnya. Suastika et al. (1997) memperoleh nilai A260/A280 sebesar 1,3 dan 12 mg virus
murni per 100 g daun segar ketika melakukan pemurnian CVB menggunakan N. clevelandii sebagai sumber virus dan metode sentrifugasi gradien sukrose. Sedangkan Hollings & Stone (1972) melaporkan bahwa nilai A260/A280 CVB
adalah 1,55.
Pemurnian virus dari kelompok carlavirus yang lain dilaporkan dari penelitian Van Lent et al. (1980) yang memurnikan Elderberry carlavirus (ECV). Purifikasi dilakukan dengan metode klarifikasi melalui presipitasi dengan garam, konsentrasi melalui presipitasi dengan PEG dan disentrifugasi dengan gradien sukrose didapatkan bahwa virus murni memiliki nilai A260/A280 = 1,17 dan dari
100 g daun Sambucus segar diperoleh 2-3 mg virus. Sharma et al. (2005) yang melakukan purifikasi terhadap LSV menggunakan gradien sesium sulfat memperloleh virus murni dengan nilai A260/A280 = 1,4.
Tingkat kemurnian virus yang dihasilkan dari penelitian ini relatif tinggi yaitu di atas rata-rata untuk virus yang partikelnya berbentuk memanjang yang memiliki rata-rata nilai A260/A280 sekitar 1,2 (Dijkstra & de Jager, 1998).
1,449
Keberhasilan pemurnian tersebut mungkin disebabkan oleh 2 faktor, yaitu metode pemurnian dan tanaman inang sumber virus yang digunakan. Metode pemurnian yang digunakan sesuai dengan prosedur dari Foster (1998), yaitu meliputi ekstraksi daun (memisahkan molekul makro tanaman) dengan kloroform yang ditambahkan enzim untuk maserasi jaringan (driselase), pencegah oksidasi (β-2 mercaptoehtanol), agen kelasi (EDTA) dan detergen pemecah membran sel (Triton X-100); klarifikasi ekstrak daun dengan sentrifugasi 5.000 g selama 20 menit; mengkonsentrasikan virus dan memisahkan dari material tumbuhan yang bermolekul kecil dengan PEG dan sentrifugasi pada 10.000 g selama 15 menit; sedimentasi dengan sentrifugasi kecepatan tinggi (30.000 g selama 90 menit); dan pemurnian dengan sentrifugasi pada cesium chloride, sentrifugasi pada 110.000 g selama 20 jam. Metode tersebut relatif lebih sederhana dan mudah dilakukan sehingga memperkecil terjadinya proses oksidasi. Terjadinya proses oksidasi sering menjadi kendala dalam setiap proses pemurnian virus tumbuhan, karena proses oksidasi mengakibatkan degradasi virus.
Perbanyakan virus pada penelitian ini menggunakan tanaman N. benthamiana. Semua tanaman (10 tanaman) N. benthamiana yang dipakai pada pengujian kisaran inang menunjukkan titer virus yang tinggi. Jumlah ini lebih tinggi dibandingkan tanaman-tanaman inang CVB lainnya seperti N. clevelandii, N. tabacum var. White Burley, N. tabacum var. Havana, P. hybrida, C. amaranticolor dan C. quinoa yang menunjukkan titer virus tinggi berturut-turut pada 8 tanaman, 3 tanaman, 5 tanaman, 6 tanaman, 3 tanaman, dan 4 tanaman (Gambar 15). Titer virus tinggi ditandai dengan nilai absorbansi sampel pada panjang gelombang 405 nm sama atau melebihi 6 kali nilai absorbansi pada kontrol negatif, pada ELISA. Dari sedikit inang CVB tersebut, N. benthamiana
adalah tanaman yang paling prospektif digunakan sebagai inang perbanyakan CVB. Di samping memiliki titer virus tinggi pada tanamn terinfeksi, biji tanaman tersebut banyak dan mudah diperoleh, mudah ditanam dan dipelihara. Sifat batang
N. benthamiana yang sukulen sangat menguntungkan karena semua bagian tanaman dapat digunakan sebagai bahan pemurnian dan akan mempermudah ekstraksinya, sehingga proses pemurnian dapat lebih mudah, cepat dan menurunkan resiko terjadinya proses oksidasi.
Gambar 15. Jumlah tanaman N. benthamiana, N. clevelandii, N. tabacum var. White Burley, N. tabacum var. Havana, P. hybrida, C. amaranticolor dan C. quinoa yang menunjukkan titer virus tinggi. Titer virus tinggi ditandai dengan nilai absorbansi 405 nm pada ELISA > 6 kali nilai absorbansi pada kontrol negatif
Morfologi dan Ukuran Partikel Virus
Hasil pengamatan dengan mikroskop elektron terhadap siapan virus murni menunjukkan adanya partikel virus yang berbentuk batang agak lurus dan lentur dengan ukuran panjang 685 nm dan lebar 12 nm (Gambar 16).
Gambar 16. Bentuk partikel CVB pada mikroskop elektron (pembesaran 40.000 kali). A : siapan perasan tanaman terifeksi CVB. B : siapan virus murni.
Bentuk dan ukuran partikel virus ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh peneliti terdahulu. Hollings & Stone (1972) mendapatkan bentuk dan ukuran partikel CVB yang sama dengan hasil pengamatan pada penelitian ini. Suastika et al. (1997) pada pengamatan siapan murni CVB menemukan partikel virus berbentuk panjang agak lentur dengan ukuran panjang 650-700 nm dan lebar 13 nm; dan pengamatan Verma et al. (2003) juga mendapatkan bentuk partikel lentur dengan ukuran 680x12 nm.
Ukuran Protein Selubung Virus
Ukuran protein selubung ditentukan dengan SDS – PAGE dan Western blot. Analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya pita yang sama pada sampel daun
N. benthamiana terinfeksi CVB dan virus murni yaitu pita protein berukuran sekitar 34 kDa (Gambar 17A), dan pita tersebut tidak nampak pada sampel daun
N. benthamiana sehat. Hal ini menunjukkan bahwa pita tersebut kemungkinan merupakan protein selubung dari virus. Konfirmasi dengan analisis Western blot
terhadap protein selubung virus menggunakan antiserum CVB menunjukkan bahwa pita protein berukuran 34 kDa bereaksi positif dengan antiserum CVB (Gambar 17B). Ini berarti bahwa memang benar pita dengan berat molekul 34 kDa tersebut adalah protein selubung CVB. Hasil pengamatan morfologi virus dan ukuran protein selubung mendukung peneliti sebelumnya yang menemukan bentuk dan ukuran partikel serta berat molekul protein selubung CVB yang sama (Suastika et al. 1997; Hollings & Stone,1972). Hull (2002) dan Lee et al. (2003) juga menyatakan bahwa virus anggota kelompok carlavirus memiliki protein selubung tunggal dengan berat molekul 31-36 kDa.
Gambar 17. Hasil analisis SDS-PAGE (A) dan Western blot (B) protein selubung CVB isolat Indonesia. M : Marker. H : daun N. benthamiana sehat. I : daun N. benthamiana terinfeksi CVB. C : virus murni.
Urutan Asam Nukleat Gen Protein Selubung Virus
Amplifikasi dengan teknik RT-PCR menggunakan primer CVB 5 dan CVB 3 berhasil mendapatkan fragmen DNA berukuran 739 bp dari sampel daun asal Medan, Cianjur, Malang dan Bali (Gambar 18). Ukuran fragmen DNA tersebut sesuai dengan yang diharapkan berdasarkan analisis runutan primer di
Plant Virus GenBank, Soul Women’s University.
Gambar 18. Hasil amplifikasi DNA CVB isolat Indonesia dengan metode RT- PCR menggunakan pasangan primer CVB 5 dan CVB 3. Lajur 1,2,3 dan 4 masing-masing menunjukkan hasil amplifikasi isolat Medan, Cianjur, Malang dan Bali. Lajur 5: marker DNA
A B 1 2 3 4 5 1000 bp 500 bp 34 kDa 34 kDa 739 bp
Fragmen DNA hasil PCR selanjutnya digunakan dalam perunutan DNA dan data yang diperoleh dari hasil perunutan kemudian dicari homologinya di
GeneBank menggunakan software Blast2.Wu. Semua runutan yang dipilih dianalisis tingkat kesamaan genetiknya menggunakan softwareClustalW. Analisis 4 runutan CVB Indonesia dengan ClustalW membuktikan bahwa keempat gen protein selubung tersebut menunjukkan homologi (Gambar 19). Bila dilihat similaritas 4 runutan CVB Indonesia dan isolat-isolat lainnya yang ada di
GeneBank, isolat CVB Cianjur, Medan, Malang dan Bali mempunyai tingkat kesamaan (similarity) berturut-turut 80-99%, 80-97%, 80-99%, dan 80-99% (Tabel 5). Isolat Cianjur ditemukan memiliki tingkat kesamaan masing-masing 99%, 97% dan 98% terhadap isolat Medan, Malang dan Bali. Isolat CVB Cianjur dan Medan memiliki hubungan yang dekat dengan tingkat kesamaan 99%; dan